Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒 - CAS号查询_生物试剂_化学试剂_分析试剂

中文名称:	Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒一键复制产品信息
英文名称:	Firefly&,Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit
别名:	Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒 Firefly&,Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit
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产品说明书

PS2043 Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (普西唐-psaitong)

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产品简介：

萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kD 的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的过程中，并伴随生物发光(Bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的过程中也伴随生物发光。生物发光是化学发光的一种形式，通过化学反应释放光能，可以通过化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪进行测定。
在 DLR 检测中，萤火虫（Firefly）萤光素酶和海肾（Renilla）萤光素酶的活性可在单个样品中依次检测。先是先以萤光素(Luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly Luciferase)，后以肠腔素(Coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla Luciferase)，并在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫萤光素酶催化Luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5' 启动子区克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 区克隆在Luciferase 的下游等，构建成报告基因(Reporter Gene)质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定萤光素酶活性。通过萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。 Renilla Luciferase 相对更多地被用作转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。
普西唐—Psaitong Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。

操作步骤：

一：样本处理
对于细胞裂解：
1：将转入报告基因的细胞中的培养基移除，加PBS 轻轻洗涤2次（贴壁细胞可直接进行此操作，悬浮细胞要离心收集细胞）。按图1方案加入 1×Lysis Buffer (用无菌水按 4:1 稀释 A 组分)，然后将培养板放在微型震荡器上室温震荡15 min，充分裂解细胞。裂解产物可室温保存6 h，-70℃可长期存放（裂解产物不能多次反复冻融）。如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100μL。
2：将充分裂解后的裂解产物，10000-15000 rpm 离心 3-5 min。离心后将上清液移入新的EP管中进行后续检测。
3：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需溶解，并达到室温后再进行测定。
对于叶片组织（以烟草叶片为例，仅供参考）
1：构建相应的载体。
2：挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到2mL LB液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃，220rpm培养过夜。
3：农杆菌培养至OD600为1.0，1700×g 离心5min收集菌体后，用1/2 MS液体培养基清洗菌体2次；
用含有150 μmol/L乙酰丁香酮的 1/2 MS 液体培养基将农杆菌的OD600调至1.0。
4：将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的OD₆₀₀为0.5。
5：选取生长期为1个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用1 mL注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。
6：正常温室生长条件下，24-48h即可取样观察。
7：取3-4片直径为6-8mm的叶盘，放入2mL的EP管中（提前放入3-4个小钢珠），液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎(45 Hz，30 s)。破碎完全后在EP管中加入100μL 1× Lysis Buffer(用无菌水按4:1稀释A组分)。
8：冰上孵育5min左右，充分裂解叶片。
9：10000-16000rpm 离心1min，取上清。
二：工作液配制
1：用B组分充分溶解C组分，配制成0.2mg/mL的萤火虫萤光素酶检测液。萤火虫萤光素酶工作液不能反复冻融，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。
2：用D组分将E组分稀释成海肾萤光素酶工作液，稀释方法为将1μL E组分加入到49μL D组分中，此稀释方法可按比例相应扩大。海肾萤光素酶工作液应该现用现配。
三：化学发光值检测
1：将上述配制好的萤火虫萤光素检测液和海肾萤光素酶工作液恢复至室温。
2：按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2s，测定时间设为10s。
3：每个样品测定时，取样品20-100μL(如果样品量足够，请加入100μL；如果样品量不足可以适当减少用量，但同批样品的使用量宜保持一致)。1×Lysis Buffer为空白对照。为防止孔间干扰，建议使用白色不透光孔板。
4：加入100μL萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫萤光素酶检测试剂后，立即进行发光值的检测。
5：在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入 100μL海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。
6：在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。
图1:

细胞培养板	96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板
细胞裂解液	30μL	60μL	120μL	250μL	500μL

组分：

组分	规格(100 T)
A：5× Passive Luciferase Lysis Buffer	10mL
B：Firefly Luciferase Assay Buffer	10mL
C：D-Luciferin	2mg
D：Renilla Luciferase Assay Buffer	10mL
E：50× Coelenterazine	200μL
组分C建议预先使用组分B配制为2 mg/mL储液，组分B、组分D及配制为储液的组分C，根据实验需求进行小批量分装。所有检测工作液建议现配现用，避免反复冻融。

保存条件：

-20℃ 12个月

注意事项：

1：使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。
2：由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
3：为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。
4：萤火虫萤光素酶催化的生物发光的最强波长560nm，海肾萤光素酶催化的生物发光的最强波长480nm。
5：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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危害声明：

安全说明：

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