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（ 母液浓度为 40 mg/mL ）, 如您需要配置的浓度超过该产品的溶解度，请先与我们客服联系。| 中文名称: | Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒 一键复制产品信息 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 英文名称: | Firefly&,Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit | ||||
| 别名: | Firefly & Renilla双荧光素酶报告基因检测试剂盒 Firefly&,Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit | ||||
| CAS No: | |||||
| CAS No: | |||||
产品简介：
双萤光素酶报告基因检测试剂盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以萤光素(luciferin)为底物来检测萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)，后以肠腔素(coelenterazine)为底物来检测海肾萤光素酶(Renilla luciferase)，并且在后续加入海肾萤光素酶底物时，同时加入抑制萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的物质，使后续检测仅仅检测到海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。
双萤光素酶报告基因检测试剂盒为检测基因的表达量提供有效的手段，在DLR 检测中，萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的活性可在单个样品中依次检测。先以萤光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫萤光素酶的活性，然后加入抑制萤火虫萤光素酶催化的物质，同时加入腔肠素（Coelenterazine）检测海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或 5' 启动子区克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 区克隆在Luciferase 的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。海肾萤光素酶更多地被用作检测转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。
萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。
本试剂盒的光信号可以通过化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪进行测定。该试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。
双萤光素酶报告基因检测试剂盒为检测基因的表达量提供有效的手段，在DLR 检测中，萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的活性可在单个样品中依次检测。先以萤光素（Luciferin）为底物来检测萤火虫萤光素酶的活性，然后加入抑制萤火虫萤光素酶催化的物质，同时加入腔肠素（Coelenterazine）检测海肾萤光素酶的活性，实现双萤光素酶报告基因检测。通过萤光素酶和其底物这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣基因的转录调控元件或 5' 启动子区克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 区克隆在Luciferase 的下游，构建成报告基因（Reporter gene）质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，通过检测萤光素酶活性的高低来判断药物处理等对目的基因的转录调控作用。海肾萤光素酶更多地被用作检测转染效率的内参，以消除细胞数量和转染效率的差异。
萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。
本试剂盒的光信号可以通过化学发光仪、酶标仪或液闪测定仪进行测定。该试剂盒具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广，无细胞内源活性干扰等特点。
操作步骤：
一：前处理
1：叶片组织（以烟草叶片为例，仅供参考）
1-1：构建相应的载体。
1-2：挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到 2 mL LB 液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm 培养过夜。
1-3：农杆菌培养至 OD600 为 1.0，1700× g 离心 5 min 收集菌体后，用 1/2MS 液体培养基清洗菌体 2 次；用含有 150 μmol/L 乙酰丁香酮的 1/2MS 液体培养基将农杆菌的 OD600 调至 1.0。
1-4：将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的 OD600 为 0.5。
1-5：取生长期为 1 个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用 1 mL 注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。
1-6：正常温室生长条件下，24-48 h 即可取样观察。
1-7：取 3-4 片直径为 6-8 mm 的叶盘，放入 2 mL 的 EP 管（提前放入 3-4 个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在 EP 管中加入 100 μL 裂解液。
1-8：冰上孵育 5 min 左右，充分裂解叶片。
1-9：10000-16000 rpm 离心 1 min，取上清。
2：原生质体（仅供参考）
2-1：构建相应的载体。
2-2：制备原生质体。
2-3：WI 溶液配置：0.5 M 甘露醇和 20mm KCl 溶于 4 mm MES (pH 5.7)，可在室温下保存。W5 溶液配置：154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 和 5 mM KCl 溶于 2 mm MES (pH 5.7)，可在室温下保存。
2-4：在 2 mL EP 管中加入相应的载体（加入量需要摸索），加入 100 μL 原生质体悬浮液。轻摇混匀后，加入 110 μL PEG-CaCl2溶液，轻弹混匀。在室温放置 10-15 min。
2-5：加入 440 μL W5 溶液，上下颠倒以停止转化。
2-6：200× g 室温离心 5 min，弃去上清，加入 800 μL WI 溶液重悬原生质体。
2-7：室温避光培养 16-24 h。
2-8：将原生质体加入 2 mL 离心管中，离心收集原生质体，加入 100 μL 左右的裂解液。
2-9：冰上孵育 5 min 左右，充分裂解原生质体。
2-10：（选做）10000-16000 rpm 离心 1 min，取上清。
二：使用步骤
1：裂解细胞
将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
1-1：对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考表1加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考表1加入适量报告基因细胞裂解液。注意：裂解产物可室温保存 6 h，-70℃可长期存放(裂解产物不能反复冻融); 如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
1-2：充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。注意：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
2：Preparation of Firefly Working Solution
2-1：将所有组分恢复至室温。
2-2：配置10 mg/mL D-luciferin储存液。2mg组份C溶解在200uL超纯水中。储存液-20℃可以储存6个月反复冻融5次。
2-3：工作液配置 ：用组分 B 按照1:50稀释以上D-luciferin储存液，配制成 0.2 mg/mL 的萤火虫萤光素酶工作液。注意：萤火虫萤光素酶工作液不能反复冻融超过5次，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。
3：Preparation of Renilla Working Solution
3-1：将所有组分恢复至室温。
3-2：配置2 mg/mL Coelenterazine储存液。400ug组份E溶解在200uL乙醇中。储存液-80℃可以储存6个月反复冻融5次。
3-3：工作液配置 ：用组分 D 按照1:50稀释以上coelenterazine储存液，配制成 0.04 mg/mL 的1x coelenterazine工作液。注意：1×Coelenterazine工作液现配现用，配置后在3小时内使用。
4：化学发光值检测
4-1：按照仪器操作说明书开启具有检测化学发光功能的仪器如酶标仪。
4-2：每个样品测定时，取样品 20-100uL(如果样品量足够，请加入 100uL；如果样品量不足可适当减少用量，但检测孔用量需保持一致）。1× Lysis Buffer 为空白对照。
4-3：加入 100uL萤火虫萤光素酶检测液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。以报告基因细胞液为空白对照。注意：由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫萤光素酶工作液后，立即进行检测。
4-4：在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，再加入 100uL 1× Coelenterazine 工作液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。
4-5：在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的 RLU 值除以海肾萤光素酶测定得到的 RLU 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。
表1:
1：叶片组织（以烟草叶片为例，仅供参考）
1-1：构建相应的载体。
1-2：挑取转化有重组质粒的农杆菌单菌落，接种到 2 mL LB 液体培养基（添加相应抗生素）中，28℃ 220 rpm 培养过夜。
1-3：农杆菌培养至 OD600 为 1.0，1700× g 离心 5 min 收集菌体后，用 1/2MS 液体培养基清洗菌体 2 次；用含有 150 μmol/L 乙酰丁香酮的 1/2MS 液体培养基将农杆菌的 OD600 调至 1.0。
1-4：将待检测的农杆菌菌液进行混合，使每种菌液的 OD600 为 0.5。
1-5：取生长期为 1 个月左右完全伸展的烟草叶片，将混合好的菌液用 1 mL 注射器(去掉针头)从烟草叶背面进行注射。为保证实验结果的一致性，需要将对照载体和待检测目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上, 以保证相同的生长背景。
1-6：正常温室生长条件下，24-48 h 即可取样观察。
1-7：取 3-4 片直径为 6-8 mm 的叶盘，放入 2 mL 的 EP 管（提前放入 3-4 个小钢珠）中，液氮中冷冻，使用破碎仪进行研磨破碎（45 Hz，30 s）。破碎完全后在 EP 管中加入 100 μL 裂解液。
1-8：冰上孵育 5 min 左右，充分裂解叶片。
1-9：10000-16000 rpm 离心 1 min，取上清。
2：原生质体（仅供参考）
2-1：构建相应的载体。
2-2：制备原生质体。
2-3：WI 溶液配置：0.5 M 甘露醇和 20mm KCl 溶于 4 mm MES (pH 5.7)，可在室温下保存。W5 溶液配置：154 mM NaCl, 125 mM CaCl2 和 5 mM KCl 溶于 2 mm MES (pH 5.7)，可在室温下保存。
2-4：在 2 mL EP 管中加入相应的载体（加入量需要摸索），加入 100 μL 原生质体悬浮液。轻摇混匀后，加入 110 μL PEG-CaCl2溶液，轻弹混匀。在室温放置 10-15 min。
2-5：加入 440 μL W5 溶液，上下颠倒以停止转化。
2-6：200× g 室温离心 5 min，弃去上清，加入 800 μL WI 溶液重悬原生质体。
2-7：室温避光培养 16-24 h。
2-8：将原生质体加入 2 mL 离心管中，离心收集原生质体，加入 100 μL 左右的裂解液。
2-9：冰上孵育 5 min 左右，充分裂解原生质体。
2-10：（选做）10000-16000 rpm 离心 1 min，取上清。
二：使用步骤
1：裂解细胞
将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
1-1：对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考表1加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考表1加入适量报告基因细胞裂解液。注意：裂解产物可室温保存 6 h，-70℃可长期存放(裂解产物不能反复冻融); 如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小为100微升。
1-2：充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。注意：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
2：Preparation of Firefly Working Solution
2-1：将所有组分恢复至室温。
2-2：配置10 mg/mL D-luciferin储存液。2mg组份C溶解在200uL超纯水中。储存液-20℃可以储存6个月反复冻融5次。
2-3：工作液配置 ：用组分 B 按照1:50稀释以上D-luciferin储存液，配制成 0.2 mg/mL 的萤火虫萤光素酶工作液。注意：萤火虫萤光素酶工作液不能反复冻融超过5次，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。
3：Preparation of Renilla Working Solution
3-1：将所有组分恢复至室温。
3-2：配置2 mg/mL Coelenterazine储存液。400ug组份E溶解在200uL乙醇中。储存液-80℃可以储存6个月反复冻融5次。
3-3：工作液配置 ：用组分 D 按照1:50稀释以上coelenterazine储存液，配制成 0.04 mg/mL 的1x coelenterazine工作液。注意：1×Coelenterazine工作液现配现用，配置后在3小时内使用。
4：化学发光值检测
4-1：按照仪器操作说明书开启具有检测化学发光功能的仪器如酶标仪。
4-2：每个样品测定时，取样品 20-100uL(如果样品量足够，请加入 100uL；如果样品量不足可适当减少用量，但检测孔用量需保持一致）。1× Lysis Buffer 为空白对照。
4-3：加入 100uL萤火虫萤光素酶检测液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。以报告基因细胞液为空白对照。注意：由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫萤光素酶工作液后，立即进行检测。
4-4：在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，再加入 100uL 1× Coelenterazine 工作液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。
4-5：在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的 RLU 值除以海肾萤光素酶测定得到的 RLU 值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。
表1:
| Cell Culture Plate | 96-well plates | 48-well plates | 24-well plates | 12-well plates | 6-well plates |
| Lysis Buffer (A) uL/per well | 20uL | 65uL | 100uL | 250uL | 500uL |
组分：
| 组分 | 组分名称 | 规格 | 储存 |
| 组分A | 1X Passive Luciferase Lysis Buffer | 10ml | -20℃,避光 |
| 组分B | Firefly Luciferase Assay Buffer | 10ml | -20℃,避光 |
| 组分C | D-Luciferin | 2mg | -20℃,避光 |
| 组分D | Renilla Luciferase Assay Buffer | 10mL | -20℃,避光 |
| 组分E | Coelenterazine | 400ug | -20℃,避光 |
| 注意：最好在-20℃保存。将 C 组分溶解到 B 组分后，该混合液不可反复冻融，建议进行小批量分装，并于-20℃(最长可储存 6 个月)条件下储存。Renilla Luciferase Assay solution（D+E）应新鲜配制，当天使用。 | |||
保存条件：
-20℃ 12个月
注意事项：
1：为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。
2：由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
3：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2：由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
3：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
分析证书(COA)
Lot/Batch Number
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
(2).jpg)
体内配方的制备方法: 取 50μLDMSO 母液，添加 300 μLPEG300 混匀澄清，再加 50μLTween80, 混匀澄清，再加 600μLSaline/PBS/ddH2O 混匀澄清
方案所需的各种助溶剂如： DMSO ， PEG300 / PEG400 ， Tween 80 ， SBE-β-CD ， 玉米油 等， 均可点击跳转或在网站搜索购买。
母液，添加 300 μLPEG300 混匀澄清，再加 50μLTween80, 混匀澄清，再加 600μLSaline/PBS/ddH2O 混匀澄清方案所需的各种助溶剂如： DMSO ， PEG300 / PEG400 ， Tween 80 ， SBE-β-CD ， 玉米油 等， 均可点击跳转或在网站搜索购买。
以上为“动物实验计算换算器”的使用方法举例，并不是具体某个试剂的配制，请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解方案。
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL Saline/PBS/ddH2O，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
剂量转换
对于不同动物的给药剂量换算，您也可以参考 更多
