SYTO9/PI 活细菌/死细菌双染试剂盒 - CAS号查询_生物试剂_化学试剂_分析试剂

中文名称:	SYTO9/PI 活细菌/死细菌双染试剂盒一键复制产品信息
英文名称:	SYTO9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit
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产品说明书

PS1384 SYTO9/PI 活细菌/死细菌双染试剂盒 (普西唐-psaitong)

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产品简介：

一款方便且操作简单的试剂盒，利用SYTO9 绿色核酸染料和碘化丙啶（PI）红色荧光核酸染料来进行细菌活力的检测，适用于大量的细菌种属，包括蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、草分枝杆菌、绿脓杆菌、金黄葡萄球菌、奥拉尼堡沙门氏菌、宋内志贺氏菌和化脓性链球菌。
本试剂盒的工作原理在于：SYTO 9 和 PI 的光谱特征以及穿透健康细菌细胞的能力不同。单独使用时，SYTO 9 能对群体内的所有细菌进行标记—具有完整膜和受损膜的细菌；相反，PI 只能渗透进入受损的膜，PI 的插入会引起 SYTO 9 染色荧光的降低，当体系内加入两种染料时，更能看出活死比例。因此，通过适量比例的 SYTO 9 和 PI 的混合染色，具有完整膜结构的细菌呈绿色荧光，而具受损膜结构的细菌呈红色荧光。两者染料的最大激发和发射波长分别是 480/500nm（SYTO 9）和 490/635nm（PI）。背景基本无荧光。本试剂盒兼容于荧光显微镜，荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或其它荧光检测仪器。

操作步骤：

一：培养条件和细菌悬液的制备
1：用营养肉汤培养大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（30ml）使其生长至对数生长后期。
2：于 10000×g 离心10-15min，浓缩 25ml 细菌培养物。
3：吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl 或适当缓冲液来重悬沉淀。
4：取 1ml 重悬菌液分别加入含 20ml 0.85% NaCl 或适当缓冲液的 30-40ml 离心管（用作活细菌），或含 20ml 70%异丙醇的 30-40ml 离心管（用作杀死细菌）。
5：两管样品于室温孵育 1h，每隔 15min 颠倒混匀一次。
6：两管样品于 10000×g 离心 10-15min。
7：用20ml 0.85% NaCl 或适当缓冲液重悬沉淀，并且按照步骤 6 再离心一次。
8：分别用10ml 0.85% NaCl 或适当缓冲液重悬两管样品。
9：分别取 3ml 菌液测定 670nm 的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm 路径）。 10：对于大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的建议染色浓度，根据你的仪器类型（荧光显微镜、荧光光度经、荧光酶标仪）或流式细胞仪来参考相应部分的染色条件。
二：染色条件的优化
试剂盒内的两种染料都经过平衡优化，按照 1：1 的比例进行混合用于绝大多数的样本都能得到良好的区分活/死细菌。偶然情况下，两种染料的混合比例需根据实际需求进行优化调整。比如：在待检样本中，绿色荧光太突出，建议要么降低 SYTO 9 浓度，要么提高PI浓度。
为了全面优化染色条件，建议测试梯度浓度的 SYTO 9，每一种浓度与梯度浓度的PI进行组合染色。建议按照 1ml细菌悬液加入3 μ l 不同混合比率的染料预混液。
三：荧光显微镜操作步骤
活菌和死菌的荧光可能用标准的荧光素长通滤片设置来同时观察。替代方案：活菌（绿色荧光）和死菌（红色荧光）可分别用荧光素和 Texas Red 带通滤光片设置。用于本试剂盒检测的建议荧光显微镜滤片设置见表 1。
1：在微量离心管内组合等量的组分 A（SYTO 9）和组分 B（PI），混匀。
2：每 1ml细菌悬液内加入3 μ l 染料预混液。按照建议的稀释倍数，最终得到的染色工作液内含0.3% DMSO。更高浓度的 DMSO 可能对染色产生副效果。
3：混匀后室温避光孵育 15min。
4：吸 5 μ l 染色的细菌悬液到载玻片上，并盖上 18mm方形盖玻片。
5：根据表 1 选择荧光显微镜上合适的滤片来观察。
四：荧光光度计操作步骤
1：调整大肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为 1×108 个细菌/ml(~0.03 OD670)或金黄色葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为 1×107 个细菌/ml (~0.15 OD670)。用于荧光光度计检测，金黄色葡萄球菌悬液的浓度通常比大肠杆菌少 10 倍。
2：参考表 2 在 1cm 玻璃、丙烯酸酯或石英荧光比色皿混匀五种不同比例的细菌悬液。每个样本的总体积为 3ml。表 2.荧光光度计法检测活/死细菌所需不同比例活细菌和死细菌悬液的加量体积
3：在微量离心管内分别加 30 μ l 组分 A（SYTO 9）和 30 μ l 组分 B（PI），混匀。
4：每组不同比例的细菌悬液内加入9 μ l 染料预混液（5 个样本×9 μ l =45 μ l 总量），用枪上下吹打数次使其混匀。
5：室温避光孵育 15min。
6：荧光测定和数据分析
用荧光光度计测定每组细菌悬液（Fcell）的荧光发射光谱（激发：470nm，发射：490-700nm）。
分别测定发射光谱在 510-540nm（em1，绿色）和 620-650nm（em2，红色）的累积荧光，并计算累积荧光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2
以大肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以累积绿色荧光与红色荧光比（RatioG/R）为纵坐标，制图。
五：荧光酶标仪操作步骤
针对细菌悬液，用荧光酶标仪的测定条件与荧光光度计的基本类似。如同荧光光度计的检测步骤，染料浓度相同于荧光显微镜的建议浓度，绿/红荧光比与活细菌相对数量呈正比。
1：调整大肠杆菌悬液（活和杀死）使其密度为 2×108 个细菌/ml（~0.06 OD670）或金黄色葡萄球菌悬液（活和杀死）使其密度为 2×107 个细菌/ml（ ~0.3 OD670）。用于荧光酶标仪检测，金黄色葡萄球菌悬液的浓度通常比大肠杆菌少 10 倍。
2：参考表 3 在 16×125mm高硼硅玻璃培养管内混匀五种不同比例的细菌悬液（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）。每个样本的总体积为 2ml。
3：在微量离心管内分别加 6 μ l 组分 A（SYTO 9）和 6 μ l 组分 B（PI），混匀。
4：通过将所有的 12 μ l 上述预混液加入2ml无菌的 dH2O，混匀后制备 2×染色混合液。
5：吸 100 μ l 细菌悬液混合物到平底 96 孔板的各孔内，建议每个制备物做三个平行。96 孔板的边缘孔通常空置以避免假读数。
6：更换新的枪头，每孔加入100 μ l 2×染色混合液，上下吹打使充分混匀。
7：室温避光孵育 15min。
8：荧光测定和数据分析
以~485nm 为激发波长，~530nm 为发射波长（emission 1，绿色）来测定每孔荧光；
以~485nm 为激发波长，~630nm 为发射波长（emission 2，红色）来测定每孔荧光；
通过测定两种发射波长下的荧光强光，并计算荧光比值：RatioG/R=Fcell,em1/Fcell,em2以大肠杆菌悬液内活细胞的占比为横坐标，以 RatioG/R 为纵坐标，制图。

表1
XF25, XF26, XF115	11001, 41012, 71010	⽤于同时观察SYTO 9和PI染⾊的长通和双发射滤光⽚
XF22, XF23	31001, 41001	仅用于观察SYTO 9的带通滤光⽚
XF32, XF43, XF102, XF108	31002, 31004, 41002, 4100	仅用于观察PI的带通滤光⽚
表2
活：死细菌比例	mL活细菌悬液	mL死细菌悬液
0:100	0	3.0
10:90	0.3	2.7
50:50	1.5	1.5
90:10	2.7	0.3
100:0	3.0	0
表3荧光酶标仪法检测活/死细菌所需不同⽐例活细菌和死细菌悬液的加量体积
活：死细菌比例	mL活细菌悬液	mL死细菌悬液
0:100	0	2.0
10:90	0.2	1.8
50:50	1.0	1.0
90:10	1.8	0.2
100:0	2.0	0

组分：

组分名称	规格(40T)	储存
SYTO 9 Solution(3.34mM)	60μl	-20°C
PI Solution（20mM）	60μl	-20°C
自备：Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes

保存条件：

-20℃,12个月

注意事项：

1：由于试剂盒内 SYTO 9 和 PI 的组分量少，室温回温充分融化后，务必低速离心沉至管底后再开盖。
2：第一次使用可将 SYTO 9 和 PI根据单次用量分装保存，密封后置于≤-20℃避光保存。
3：Mounting oil, for bacteria immobilized on membranes用于将细菌固定在膜上，25℃的折射率是 1.517 ± 0.003。不要用作浸油（Immersion oil）。
4：SYTO 9 和 PI 结合核酸，PI 是潜在的诱变剂，目前没有数据阐明 SYTO 9 的诱变性或毒性，两种试剂使用都需做恰当防护。DMSO 能促进有机分子进入组织。强烈建议处理 DMSO 储存液时戴双层手套。对于核酸染料，含此类染料的试剂经活性炭吸附后再进行废液处理。活性炭之后经焚烧来破坏染料。
5：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

UN码：

HazardClass：

危害声明：

安全说明：

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