T7体外转录试剂盒 - CAS号查询_生物试剂_化学试剂_分析试剂

中文名称:	T7体外转录试剂盒一键复制产品信息
英文名称:	T7 In Vitro Transcription Kit
别名:	T7体外转录试剂盒 T7 In Vitro Transcription Kit
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产品说明书

PS2052 T7体外转录试剂盒 (普西唐-psaitong)

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产品简介：

本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

操作步骤：

一、制备DNA模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考）
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点：
1、必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2、需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列5′TAA TAC GAC TC A CTA TAG GG 3′加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。
3、需要转录的DNA序列下游端最好不要是3′突出。如果是3′突出（比如选择Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。
4、必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收的方法纯化质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。如果有RNase污染，则必须反复酚氯仿抽提去除残留的RNase然后再乙醇沉淀质粒DNA。
二、体外转录反应
1、如果有N个样品，强烈建议做一个阴性对照，故共设置N+1个反应，这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA，哪个条带是转录扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：
注意：2x T7 In Vitro Transcription Mix容易产生结晶，沉淀一定要握在手中直到结晶彻底溶解并摇匀后方可使用。

成分	N个样品管	阴性对照管
DNA模板	100-500ng左右的PCR片段或线状质粒	-
2xT7 In Vitro Transcription Mix	各10μL	10μLNuclease-free Water
Nuclease-free Water	至20μL	至20μL

注意：此为20μL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的2xT7 In Vitro Transcription Mix已经含有NTP。如果需要标记RNA探针或制备带帽RNA，则需要订购NTP分开的试剂盒。
2、37℃保温2-12小时(注意：延长保温时间并不能大幅提高产量。)
3、加入2μL自备的500mM的EDTA溶液灭活T7 RNA聚合酶。
4、取5μL电泳，此时最好加上一个DNA模板做电泳对照。电泳时比阴性对照多出的条带就是转录扩增得到的RNA，由于合成的RNA长度不均匀，即使长度均匀，但由于自身形成发夹结构，泳动速度也不一致，所以电泳所得RNA条带一般都不是清晰单一条带，而是比较弥散的电泳条带。但由于RNA是单链，分子量比同样长度的DNA小一倍，因此RNA一般比其双链DNA模板电泳速度更快。
5、定量，可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度。不推荐使用电泳定量。使用本试剂盒时1μg的DNA模板一般可以合成2-6μg的RNA。
6、得到的RNA可以放80℃保存。如需去除DNA模板，请按下面步骤操作。
三、去除DNA模板（所需试剂需要另购）
1、在20μL体积的体外转录体系中加入2μL的10×DNase I Buffer和1μL自备的RNase-free DNase I 3-5U/μL。
2、37℃保温30分钟。
3、补RNase-free水到100μL。增加体积可以减少样品的丢失。
4、用自备的等体积100μL的Tris饱和酚和氯仿震荡混匀后14000g离心3分钟将上清转移到新的离心管中。此步去除DNase和RNA聚合酶。
5、加自备的200μL无水乙醇和10μL 3M的乙酸钠溶液（pH5.2），振荡后14000rpm离心20分钟，RNA形成沉淀，弃上清。
6、在沉淀中加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后14000g离心5分钟，弃上清。
7、短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。不要丢失沉淀。
8、晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。
去除DNA模板也可以用PCR产物纯化回收试剂盒。

产品特点：

1、即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验不需要单独准备每一个成份。
2、单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3、模版DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4、可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000nt之间。
5、产品配方经过精心优化，每1μg DNA模版可以合成2～6μg RNA。
6、得到的RNA可用于RNA结构研究、体外翻译、RNA蛋白质相互作用、反义技术、SELEX和RNA干扰（RNAi）等实验。

自备材料：

1、Tris饱和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇。

组分：

组分名称	PS2052-20T	Storage
2xT7 In Vitro Transcription Mix	0.2ml	-20˚C
Nuclease-free Water	1ml	-20˚C

常见问题：

1、没有RNA产物。
可能原因是模板有RNase污染，可用纯化好的RNA跟模板DNA一起保温再电泳，再检测其是否有污染。
2、 RNA产量低。
可能原因是DNA模板序列导致。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。
可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。
4、RNA长度比预计的长。
T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸?
如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。
6、用体外转录试剂盒如何得到带帽RNA?
需加入带帽NTP类似物即可。

保存条件：

-20˚C,12个月。

注意事项：

1、由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
2、如果希望合成加帽的RNA，须自备Cap analog，如m7(3’-O-methyl)-G(5’)ppp(5’)G等。
3、如果希望合成生物素、地高辛、FITC、Cy3等标记的RNA或带有特殊修饰的RNA，相应的修饰NTP需要自备。
4、试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、以上信息仅做参考交流之用。

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