| 中文名称: | Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 一键复制产品信息 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 英文名称: | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | ||||
| 别名: | Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | ||||
| CAS No: | |||||
| CAS No: | |||||
产品简介：
磷脂酰丝氨酸（PS）是⼀种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，⽽在细胞凋亡早期，细胞膜 PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表⾯。Annexin V是⼀种分⼦量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋⽩，与磷脂酰丝氨酸有⾼度亲和⼒，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之⼀。
将Annexin V进⾏绿⾊荧光（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利⽤荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发⽣。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是⼀种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。因此采⽤Annexin V与PI双染的⽅法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
将Annexin V进⾏绿⾊荧光（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利⽤荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发⽣。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是⼀种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。因此采⽤Annexin V与PI双染的⽅法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
操作步骤：
1、细胞样品的准备：
(a)悬浮细胞：
(1）收集细胞⾄离⼼管中 1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼去除上清。
(2）⽤ 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
(3）再加⼊ 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
(b) 贴壁细胞：
(1）吸出细胞培养液⾄离⼼管中，PBS 洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含 EDTA 的胰酶细胞消化液消化细胞。
(2）室温孵育⾄轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
(3）加⼊以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
注：加⼊的细胞培养液⼀⽅⾯可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另⼀⽅⾯细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加⼊的 Annexin V-FITC 导致染⾊失败。
(4）⽤ 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
(5）再加⼊ 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
2. ⽤去离⼦⽔按 1：4 稀释 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去离⼦⽔）；
3. 用 250µl 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106 /ml；
4. 取 100µl 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；
5. 室温(20-25℃)避光孵育 10min；
6. 上机前 5min 加⼊ 10µl 碘化丙啶溶液，轻轻混匀；
7. 上机前在反应管中补加 400µl PBS 重悬细胞，避光保存，随即进⾏流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V-FITC 为绿⾊荧光，PI 为 红⾊荧光。
(a)悬浮细胞：
(1）收集细胞⾄离⼼管中 1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼去除上清。
(2）⽤ 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
(3）再加⼊ 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
(b) 贴壁细胞：
(1）吸出细胞培养液⾄离⼼管中，PBS 洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含 EDTA 的胰酶细胞消化液消化细胞。
(2）室温孵育⾄轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。
(3）加⼊以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
注：加⼊的细胞培养液⼀⽅⾯可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另⼀⽅⾯细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加⼊的 Annexin V-FITC 导致染⾊失败。
(4）⽤ 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
(5）再加⼊ 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离⼼ 5min，⼩⼼吸除上清。
2. ⽤去离⼦⽔按 1：4 稀释 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml 去离⼦⽔）；
3. 用 250µl 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106 /ml；
4. 取 100µl 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；
5. 室温(20-25℃)避光孵育 10min；
6. 上机前 5min 加⼊ 10µl 碘化丙啶溶液，轻轻混匀；
7. 上机前在反应管中补加 400µl PBS 重悬细胞，避光保存，随即进⾏流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V-FITC 为绿⾊荧光，PI 为 红⾊荧光。
自备材料：
微量移液器；PBS；不含 EDTA 的胰酶消化液；低速离⼼机；流式细胞仪
组分：
| Reagents | 20 assays | 50 assays | 100 assays | Storage |
| Annexin V-FITC | 100 uL | 250 uL | 500 uL | 4°C 避光 |
| Propidium Iodide, PI | 200 uL | 500 uL | 1000 uL | 4°C 避光 |
| Binding Buffer ( 4×) | 4 ml | 10 ml | 20 ml | 4°C |
保存条件：
2-8°C
注意事项：
1. 此试剂盒仅供研究使⽤。
2. 微量试剂需离⼼数秒将试剂收集⾄管底后再开盖取⽤。
3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
4. Annexin V-FITC 中含有剧毒成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
5. 本试剂盒⽤于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量在 1x105 ～1x106 。
6. 染⾊后宜尽快检测，时间过⻓可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
7. Annixin V 检测凋亡细胞的⽅法适⽤于悬浮⽣⻓的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁⽣⻓的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较⾼的假阳性，⽽⽤细胞刮⼦会造成细胞粘连成团，⽽影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防⽌进⼀步的损伤。尽管⽬前，包括国外也有⼀些单位采⽤该⽅法检测贴壁⽣⻓的细胞。我不推荐⽤该⽅法检测。因为其重复性较差，且需要操作时⾮常⼩⼼。
8. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解 Annexin V-FITC，最终导致染⾊失败。
9. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
2. 微量试剂需离⼼数秒将试剂收集⾄管底后再开盖取⽤。
3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
4. Annexin V-FITC 中含有剧毒成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
5. 本试剂盒⽤于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量在 1x105 ～1x106 。
6. 染⾊后宜尽快检测，时间过⻓可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
7. Annixin V 检测凋亡细胞的⽅法适⽤于悬浮⽣⻓的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁⽣⻓的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较⾼的假阳性，⽽⽤细胞刮⼦会造成细胞粘连成团，⽽影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防⽌进⼀步的损伤。尽管⽬前，包括国外也有⼀些单位采⽤该⽅法检测贴壁⽣⻓的细胞。我不推荐⽤该⽅法检测。因为其重复性较差，且需要操作时⾮常⼩⼼。
8. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解 Annexin V-FITC，最终导致染⾊失败。
9. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
