( 母液浓度为 40 mg/mL ), 如您需要配置的浓度超过该产品的溶解度,请先与我们客服联系。-20°C, 1 month。
(protect from light, stored under nitrogen)
一、制备 ORO 储备液
1、在 250 mL 瓶中加入 500 mg ORO 粉末和 100 mL 100% 异丙醇,充分混合。
2、配制完成后,将溶液密封保存,避免光照。
二、制备 ORO 工作液
1、将 ORO 储存液用水稀释至 60%异丙醇(体积比为 3:2)。
2、使用前,用 0.2 μm 醋酸纤维素无菌注射器过滤器过滤工作液。
注:为获得最佳溶液质量,建议提前一天配制 ORO 工作液并混合过夜。若需当天使用,需将稀释后的溶液在摇床上混合至少 2 小时。摇动前用石蜡膜包裹离心管以防泄漏。
三、准备样品
1、在 20°C 条件下,将线虫培养于接种了 OP50 大肠杆菌(对数后期)的线虫生长培养基(NGM)上,直至目标发育阶段。 2、向培养皿中加入 1 mL PBST 溶液(含 0.01% Triton X-100),轻轻摇晃使线虫脱离培养基。倾斜培养皿并用 1 mL PBST 冲洗,将线虫悬液转移至 1.5 mL 离心管。
3、以 560 × g 离心 1 分钟,弃上清,保留沉淀。重复用 1 mL PBST 洗涤三次,最后弃上清仅保留100 μL。
4、向线虫沉淀中加入 600 μL 40% 异丙醇,室温下摇动孵育 3 分钟。
5、以 560 × g 离心 30 秒,弃上清仅保留 100 μL,注意勿扰动线虫沉淀。
注:若进行高通量染色,需增加 PBST 体积。线虫在 PBST 中洗涤时间不得超过 15 分钟。若上清中仍有细菌,需额外洗涤。使用摇床或振荡器进行 40% 异丙醇孵育,确保样品充分混匀。
四、染色脂质体
1、向每份样品中加入 600 μL ORO 工作液,颠倒离心管三次以充分混合线虫与染色液。2、室温下以 30 rpm 旋转孵育 2 小时。
3、以 560 × g 离心 1 分钟,弃上清仅保留 100 μL。
4、用 600 μL PBST 重悬样品,以 30 rpm 旋转孵育 30 分钟以去除多余染色液。
5、以 560 × g 离心 1 分钟,弃上清仅保留 50 μL。
6、为更好区分线虫的生殖细胞和肠道细胞核,可在每 1 mL ORO 工作液中加入 1 μL DAPI,染色2 小时后制片成像。肠道细胞核较大,生殖腺可通过发育中的生殖细胞识别。
注:ORO 染色后,线虫可能黏附于离心管壁而无法形成明显沉淀。若发生此情况,可再次离心或静置至少10分钟使线虫沉降。
五、制片
1、将线虫沉淀重悬于剩余上清液中,充分混匀。
2、取 5 μL 线虫悬液滴于载玻片,小心盖上盖玻片以避免气泡。
3、用指甲油密封盖玻片边缘后进行成像。
注:固定和染色后的线虫可能僵硬,难以吸取。建议剪去移液器吸头尖端以扩大孔径。若无法立即成像,可将载玻片存放于 4°C 的离心管架中,最长 24 小时。
六、成像
1、使用具备彩色成像功能的显微镜相机拍摄 ORO 染色线虫。
2、用 5X 物镜拍摄以涵盖多个线虫视野,切换至 10X 物镜以观察单个线虫细节。
3、将图像以 TIF 格式导出以避免压缩导致数据丢失。
注:若使用 ORO+DAPI 染色,需切换至荧光成像模式。
七、结果分析
1、将图像导入 Image J。若文件格式不被识别,可通过插件菜单中的 Bio-Formats 功能读取。
2、在图像菜单的“堆栈(Stacks)”功能下,使用“Images-to-Stack”将多张图像合并为堆栈以便比较。
3、调整“亮度/对比(Brightness/Contrast)”以增强脂滴可见性。
4、根据脂质在全身或特定组织的积累情况对图像进行分类。
5、为评估脂质定位并识别非特异性伪影,可在图像菜单的“颜色(Color)”中选择“Stack to RGB”,分别显示 RGB 通道信号。
2、以上信息仅做参考交流之用。
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系,公式为:
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液,使用的计算公式为:
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为:C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
母液,添加 300 μLPEG300
混匀澄清,再加 50μLTween80, 混匀澄清,再加 600μLSaline/PBS/ddH2O
混匀澄清方案所需的各种助溶剂如: DMSO , PEG300 / PEG400 , Tween 80 , SBE-β-CD , 玉米油 等, 均可点击跳转或在网站搜索购买。
计算结果:
工作液浓度: mg/ml;
DMSO母液配制方法: mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL,
体内配方配制方法:取 μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL Saline/PBS/ddH2O,混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的;
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入,进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液,可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
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