| 中文名称: | G 418 二硫酸盐 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 英文名称: | G 418 disulfate salt | ||||
| 别名: | 遗传霉素 G418 | ||||
| CAS No: | 108321-42-2 | 分子式: | C20H40N4O10.2H2SO4 | 分子量: | 692.71 |
| CAS No: | 108321-42-2 | ||||
| 分子式: | C20H40N4O10.2H2SO4 | ||||
| 分子量: | 692.71 | ||||
包装规格：
250mg 1g 5g in glass bottle
产品简介：
G 418 二硫酸盐是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传实验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
G418为水溶性盐，常温保存可达1年。水溶液应冷冻保存。筛选所需的G418的量会随着细胞类型和生长周期的不同而变化。虽然增殖中细胞比没有增殖的细胞更早受到影响，但是处于指数生长期的细胞仍然需要3到7天的时间进行筛选。
G418为水溶性盐，常温保存可达1年。水溶液应冷冻保存。筛选所需的G418的量会随着细胞类型和生长周期的不同而变化。虽然增殖中细胞比没有增殖的细胞更早受到影响，但是处于指数生长期的细胞仍然需要3到7天的时间进行筛选。
溶解性：
溶于水（50mg/ml)
储备液保存：
一：G418储存液的配制（50 mg/mL，活性浓度）
1、活力单位的换算：根据此公式进行换算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异。可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
比如若所用批次的G418 活力值为：500 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/500×50 mg/mL=100 mg/mL。
2、除菌和保存根据上述换算得到的实际粉末称重量，加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量放到-20℃冻存，1年稳定。
【注】：①不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着未完全溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低终液的活性。②不建议使用液体培养基，NaCl,磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。
二：常用筛选浓度
一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件，细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。
通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL；以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。
细胞类型 激活浓度 应用
网柄菌属 a) 10 μg/mL
b) 30 μg/mL a）培养在培养液中；
b）培养在冻干细菌上；
哺乳动物 a) 400 -1000 μg/mL
b) 200 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
植物 a) 25-50 μg/mL
b) 10 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
酵母 a) 500 μg/mL
b) 125-200 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
细菌 8-16 μg/mL 用于筛选
三、杀灭曲线的建立
【注】：为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。
1、第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜；
【注】：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。
2、根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3、第二天：去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。
4、接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
5、按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
四、稳定转染细胞的筛选
1、转染48 h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。
【注】：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，最好将细胞稀释至丰度不超过25%。
2、每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。
3、筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。
4、挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
5、之后更换正常培养基培养即可。
【注意事项】
1、本品不可高压灭菌
2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。
3、配制G418溶液时，一定要根据G418批次不同的活力值（potency）来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4、G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞（未转染）可能抗生素添加5-7天后才能杀死，转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5、即使加入杀死剂量的G418，细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。
1、活力单位的换算：根据此公式进行换算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异。可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
比如若所用批次的G418 活力值为：500 µg/mg，要配制50 mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/500×50 mg/mL=100 mg/mL。
2、除菌和保存根据上述换算得到的实际粉末称重量，加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。之后使用此滤器过滤，除菌后分装成单次使用的小量放到-20℃冻存，1年稳定。
【注】：①不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着未完全溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低终液的活性。②不建议使用液体培养基，NaCl,磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。
二：常用筛选浓度
一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件，细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。
通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL；植物细胞：10-100 μg/mL；酵母细胞：500-1000 μg/mL；以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。
细胞类型 激活浓度 应用
网柄菌属 a) 10 μg/mL
b) 30 μg/mL a）培养在培养液中；
b）培养在冻干细菌上；
哺乳动物 a) 400 -1000 μg/mL
b) 200 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
植物 a) 25-50 μg/mL
b) 10 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
酵母 a) 500 μg/mL
b) 125-200 μg/mL a）用于筛选
b）用于维持生长
细菌 8-16 μg/mL 用于筛选
三、杀灭曲线的建立
【注】：为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。
1、第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜；
【注】：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。
2、根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000 μg/mL。
3、第二天：去除旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。
4、接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
5、按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
四、稳定转染细胞的筛选
1、转染48 h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。
【注】：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，最好将细胞稀释至丰度不超过25%。
2、每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。
3、筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。
4、挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
5、之后更换正常培养基培养即可。
【注意事项】
1、本品不可高压灭菌
2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。
3、配制G418溶液时，一定要根据G418批次不同的活力值（potency）来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4、G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞（未转染）可能抗生素添加5-7天后才能杀死，转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5、即使加入杀死剂量的G418，细胞可能会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。
体外实验：
1、先将使用到的所有器具去除内毒素和其它污染源，仪器表面、工作台面消毒。
2、在分析天平上称取G418粉末1.00 g，加20 mL 无菌水溶液溶解。
3、用专用的超滤滤膜过滤到去除内毒素的容器中，然后分装到 1.5 mL EP管中。
4、不建议使用螺旋盖管子，容易污染。-20度保存，避光。为避免污染和失效，建议分装成小规格的，如500 uL。
2、在分析天平上称取G418粉末1.00 g，加20 mL 无菌水溶液溶解。
3、用专用的超滤滤膜过滤到去除内毒素的容器中，然后分装到 1.5 mL EP管中。
4、不建议使用螺旋盖管子，容易污染。-20度保存，避光。为避免污染和失效，建议分装成小规格的，如500 uL。
体内实验：
将生理盐水加入产品，现配现用：30 mg/mL
体外研究：
G418浓度为1-300 microgram/ml时，抑制多种原核和真核生物。来自Tn5（编码氨基糖苷3'-磷酸转移酶，APT 3' II）的neo基因赋予G418抗性，通常用在实验室研究中用于筛选基因工程细胞。一般作用于细菌和藻类的浓度为5 mg/L或更低，筛选哺乳动物细胞的浓度为400 mg/L，维持哺乳动物细胞的浓度为200 mg/L。筛选耐药株可能需要1周到长达3周。
体内研究：
40 到 80 mg/kg剂量的G418连续处理三天，足以消除所有来自感染小鼠的未转染的T. brucei brucei寄生虫。
动物实验：
Animal Models: 血液中含T. bruceibruceiGUTat 3.1和 T.
bruceibruceiGUTat 3.1/BBR3的亚致死量辐射的小鼠
Formulation: 溶于无菌水
Dosages: 10, 20, 30, 40, 50, 或 80 mg/kg
Administration: 腹腔注射
bruceibruceiGUTat 3.1/BBR3的亚致死量辐射的小鼠
Formulation: 溶于无菌水
Dosages: 10, 20, 30, 40, 50, 或 80 mg/kg
Administration: 腹腔注射
注意事项：
1、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2、以上信息仅做参考交流之用。
2、以上信息仅做参考交流之用。
保存条件：
2-8℃ 避光
UN码：
HazardClass：
危害声明：
安全说明：
搜索质检报告(COA)
参考文献 & 客户发表文献
本计算器可帮助您计算出特定溶液中溶质的质量、溶液浓度和体积之间的关系，公式为：
质量 (g) = 浓度 (mol/L) x 体积 (L) x 分子量 (g/mol)
摩尔浓度计算公式
用本工具协助配置特定浓度的溶液，使用的计算公式为：
开始浓度 x 开始体积 = 最终浓度 x 最终体积
稀释公式
稀释公式一般简略地表示为：C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )
