中文名称: Tris-Tricine-SDS-PAGE 缓冲液
英文名称: Tris-Tricine-SDS-PAGE Buffer
CAS No:
分子式:
分子量:
PS0744 Tris-Tricine-SDS-PAGE 缓冲液 阳极,10× (psaitong)
产品描述:

Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)是目前电泳法变性分离多肽的主要方法,可以制备20/50块0.75 mm×14cm×14cm 胶。

使用方法:

推荐在分离多肽时使用由 4%浓缩胶、10%隔离胶和 16%分离胶从上到下组成的三层 Tricine-SDS-PAGE 胶,下面为配制该胶的流程。

1.  配制 30 mL 16%分离胶和 9 mL 10%隔离胶(足够灌两块 0.75 mm× 14 cm×14 cm 胶)。

1) 标记 2 个 50 mL 的三角瓶,按下表的用量加入各成分:

 成分  分离胶 隔离胶 
 30%丙烯酰胺甲叉溶液(29:1) 货号PS0008  16.0mL  3.0mL
 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶缓冲液(3×) 货号PS0747  10.0mL  3.0mL
 50%甘油 货号PS0748  3.2mL  --
 去离子水  0.8mL  3mL
 总体积  30.0mL  9.0mL

 2) 混匀后真空脱气 10-15 分钟。 

3) 在分离胶瓶中加入 150 uL 10%的 APS 溶液和 30 uL TEMED溶液, 轻轻旋转混匀。 

4) 灌胶。用一根巴斯德吸管,将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中,直到溶液的高度距离玻璃上沿还有5 cm。由于分离胶比重比隔离胶大,故可在其凝固前直接灌隔离胶。 

5) 在隔离胶瓶中加入 75 uL 10%的APS溶液和15 uL TEMED溶液, 轻轻旋转混匀。 

6) 灌胶。用巴斯德吸管,将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到 玻璃平板夹层中,直到溶液离玻璃板顶部约3cm高为止。

7) 盖 1cm 高的水饱和的异丁醇使胶面跟氧气隔绝(氧气会抑制胶的凝固;此处水饱和的异丁醇可用水代替,但效果会差一些)。

8) 让分离胶和隔离胶在室温聚合30-45 分钟。

 

2. 配制 9 mL 4%浓缩胶(足够灌两块 0.75 mm×14 cm×14 cm 胶)。

 1) 在一个 50 mL 的三角瓶中,先按下表的用量加入各成分:

 成分 用量 
  30%丙烯酰胺甲叉溶液(29:1) 货号PS0008  1.2mL
 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶缓冲液(3×) 货号PS0747  3.0mL
 补充去离子水至9mL  需加4.8mL

2) 混匀后真空脱气 10-15 min。 

3) 将 75 uL 新鲜配制的 10%的过硫酸铵溶液和 15 uL TEMED 溶液加 入到溶液中,轻轻旋转混匀。

4) 灌胶。用巴斯德吸管,将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到 玻璃平板夹层中,直到夹层中的溶液离玻璃板顶部约 1 cm 高为止。 

5) 插入 0.75 mm 厚的塑料梳子,再补加浓缩胶溶液填满梳子间的空隙。 注意避免产生气泡。 

6) 让浓缩胶在室温聚合 30-45 分钟。

 

3. 小心拔出塑料梳子,在上层缓冲槽中加入 1×阴极缓冲液,并用 1×阴极缓冲液冲洗加样孔。

注:10×Tricine-SDS-PAGE阴极缓冲液用去离子水1:9稀释成 1×阴极缓冲液。

 

4. 在电泳装置的下层缓冲液槽中加入 1×阳极缓冲液。

注:10×Tricine-SDS-PAGE阳极缓冲液用去离子水1:9稀释成 1×阴极缓冲液。

 

5. 在密封的螺盖微量离心管中,用2×Tricine多肽上样缓冲液按1: 1 的比例稀释蛋白样品,于 100℃煮沸 3-5 分钟。

注意:如果样品是蛋白沉淀物,则加入 50-100 uL 新配的 1×Tricine-SDS-PAGE 上样缓冲 液溶解;如果样品是蛋白稀溶液,可先浓缩蛋白质。与Tricine-SDS-PAGE 上样缓冲液混合后的样品如未经 100℃加热灭活蛋白酶,切勿放于室温。

 

6. 上样。如果用考马斯亮蓝染色,对于成分复杂的蛋白质样品,上样量最好为 20 uL(含 25-50 ug 总蛋白质);对于只有一种或几种蛋白质的样品, 上样量最好为 1-10 uL。如果用银染,上样量可减少 10-100 倍。

 

7. 电泳。先 30 V 恒压电泳 1 h(对 0.75mm×14cm×14cm 的胶而言), 然后 150 V 恒压电泳 4-5 h。注:本产品的 Tricine-SDS-PAGE 上样液 使用了考马斯亮蓝 G-250 作为指示剂,其泳动速度比最小的肽还快。

 

8. 终止电泳,取出凝胶进行后续的实验处理(最好用银染染色,节约样品)。 

注意:考染或银染时,基本步骤同蛋白电泳,但任何一步(尤其是固定步 骤)的处理时间都不要超过 20 分钟,否则多肽非常容易扩散出 PAGE 胶 而降低检测的灵敏度。

 

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PS0008 丙烯酰胺甲叉溶液 30%,29:1  100mL/500mL/2L
PS0123 过硫酸铵溶液 10% 10mL
T20005 TEMED ≥99.5%,生物技术级,适用于电泳 25mL/100mL/500mL

 

 

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稀释公式

稀释公式一般简略地表示为:C1V1 = C2V2 ( 输入 输出 )

  • * = *

连续稀释计算器方程

  • 连续稀释

  • 初始浓度:
  • 稀释倍数:
  • 计算结果

  • C1=C0/X C1: LOG(C1):
    C2=C1/X C2: LOG(C2):
    C3=C2/X C3: LOG(C3):
    C4=C3/X C4: LOG(C4):
    C5=C4/X C5: LOG(C5):
    C6=C5/X C6: LOG(C6):
    C7=C6/X C7: LOG(C7):
    C8=C7/X C8: LOG(C8):