常用的实验方法与技术
2020-04-24
一：分光光度法
光是一种电磁波，当光通过透明溶液介质时，部分光会被吸收，这种光被溶液吸收的现象可用于某些物质的定性及定量的测定。利用物质具有特征性的吸收光谱，测定被测物质溶液在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对其进行定性和定量分析的方法称为分光光度法。发光光度法在医药研究、环境监测、农业等各领域都有十分广泛的应用，可进行定性分析、定量分析、纯度分析和结构分析。在医药研究中，主要用于临床分析、疾控分析、生物领域的微量样品测定、人体生物指标分析、代谢产物分析和药品分析等。
1：分光光度技术的基本原理
光是由光子组成的，光线是高速运动的光子流。和其他电滋波一样，传播性质呈波动性质，有波长和频率的特征。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。其中波长390-780nm的光为可见光，波长10-400nm的为紫外光，波长760-1mm的为红外光。具有同一波长的光称为单色光，具有不同波长的光称为复合光。当一束光通过某物质溶液时，如果溶液不吸收其中的光，则呈无色透明，如果溶液能够吸收某波长的光，则呈现出被吸收光的互补色。有的溶液能够吸收紫外光，比如核酸和蛋白质溶液。
分光光度技术能够进行物质的定量分析，其依据的基本原理是Lambert-Beer定律。该定律阐明了溶液对单色光吸收的程度与溶液的浓度及液层厚度之间的定量关系。
当一束平行的单色光通过某有色溶液时，一部分光被吸收，一部分则透过该溶液，一部分被比色皿表面反射。在测定时，由于采用相同质地的比色皿，反射光的强度基本相同，所以其以不予考虑。
设光原来的强度即入射光强度为Io，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则I0=Ia+Ito，透射光强度与入射光强度之比表示光线透过溶液的程度，被称为透光度(transmittance)，用T表示：
T=It/Io
透光度越大，溶液对光的吸收程度越小，反之，透光度越小，溶液对光的吸收程度越大。透光度的负对数称为吸光度(absorbance)，用A表示，亦称光密度(optical density,OD)。用T表示：
A=1g(1/T)
溶液对光的吸收程度除了与溶液本身的性质有关外，还与入射的光波长、溶液的浓度、液层的厚度及温度等有关。
二. 电泳技术
电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。很多重要的生物分子，如蛋白质，核酸，氨基酸，核苷酸等，都具有要以解离的基团，在溶液中能够形成带电荷的颗粒，因而在电场的作用下会发生移动，各种分子的结构，性质，大小，形状及其所带净电荷的多少不同， 在电场中移动的速度不同， 因此通过电泳能够将混合物中的各种保姆妈妈根据大小，形状和电荷多少不同而分离开。因电泳技术具有操作简便，速度较快，实验设备要求不高的特点，已经成为生物技术实验的一项基本技术。电泳实验时需要使用的仪器包括电泳仪电源，电泳槽和配件及凝胶成像分析系统等。
一： 电泳技术的基本原理
由于不同物质带电性质不同， 因而在一定地电场强度下的移动速度不同。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。即
式中：u为迁移率；
v为颗粒的泳动速度（cm/s或cm/min)；E为电场强度或电势梯度（V/cm);
d为颗粒泳动距离（cm); 
l为支持物的有效长度（cm); 
v为加在支持物两端的实际电压（V）；
l为通过时间（s或min ). 通过测量d,l,v,t便可计算出颗粒的迁移率。
在电泳过程中，带电粒子的移动速度v除与粒子所带电荷量Q及电场强度E 有关外，还与粒子半径r及介质的黏度n有关：
π是适用于球形带电粒子的经验数值，对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不同。可见，带电粒子的移动速度和粒子的本身的性质有密切关系，粒子表面所带电荷量和物质的组成结构有密切关系，此外，粒子的在小（相对分子质量）及粒子的形状了有重要的影响。所以，在一定的电强度下，不同种类的带电物质在电泳时的移动速度就不能完全一致，这种移动速度的差异就是电泳技术的基本依据。
迁移率会受到三种因素的影响：1 带电颗粒本身的性质，如颗粒所带净电荷量，颗粒的大小和颗粒的形状等因素。一般来说，颗粒带净电荷量多，颗粒直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快，形成依次排列的不同区带而被分开，即使两个分子具有相似的电荷，如果分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移率也不同，在电泳过程中可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。2 带电颗粒所处的环境的影响，包括缓冲液的浓度，PH，离子强度和温度等因素。例如，离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢。3 电场的强度，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度正比。
二：常用的电泳方法
电泳可分为无支持介质的自由电泳和有固定支持介质的区带电泳两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳，显微电泳，等电聚焦电泳，等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括虑纸电泳，薄层电泳，凝胶电泳等。现在一般实验室常规电泳过程都是在一种固定支持介质中进行的，属于固定支持介质的区带电泳。目前使用最多的固定支持介质是凝胶，凝胶的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术的操作变得十分简便，分辨率较高，因此电泳技术成为蛋白质，核酸等生物大分子分析的重要手段之一。目前使用最多的凝胶是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰氨凝胶。
1：醋酸纤维薄膜电泳
采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维薄膜电泳，醋酸纤维是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮，氯仿，氯乙烯，乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后成为醋酸纤维膜。醋酸纤维一种良好的金牛支持物， 具有电泳速度快，电渗现象小，对样品吸附小及经透明处理后标本可以长期保存等优点。
2：琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳。凝胶糖凝胶具有多孔网状结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子小，体现为“分子筛”和“电泳”双重作用，大大地提高了分辨能力。
琼脂糖凝胶通常制成板状，凝胶浓度以0.8%~1.0%为宜，在此浓度下，制成的凝胶富有弹性，坚固而不脆。在制作的过程中，应避免长时间加热。
琼脂糖凝胶电泳具有较高分辨率，重复性好，区带易染色，洗脱和定量，以及干膜可以长时间保存等优点。因此，广泛用于大分子物质如蛋白质，核酸等的分离分析。
3：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，该凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳也具有“分子筛”和“电泳”双重作用，具有更高的分辨能力。一般来说，纸电泳仅能将血清蛋白分成5~7个组分，而聚丙烯酰胺凝胶电泳则可分为20~30个组分。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛用于蛋白质，核酸等生物大分子的分离鉴定和分子量的测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲液，PH和凝胶孔径都是相同的，而后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，PH和凝胶孔径等。不连续电泳除具有“分子筛”和“电泳”双重作用外，尚具有浓缩效应，可将样品在分离前浓缩成层，从而提高分辨能力。
三：电泳技术的应用
电泳技术在基础研究中的应用
电泳技术主要用于分离和纯化氨基酸，多肽，蛋白质，脂类，核苷酸，核酸等各种和机物；也可用于DNA的测序，物质纯度和分子质量的测定等。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。
电泳技术在临床疾病诊断中的应用
在临床疾病诊断中，电泳技术被用于血清蛋白，尿蛋白，脂蛋白，同工酶的分离和鉴定进行肾，肝和心脏等疾病的诊断。为各种相关疾病的诊断，鉴别诊断，疗效观察及判断预后提供了方便。
电泳技术在中药鉴定中的应用
电泳技术可用于中药中的生物碱，多糖，有机酸和氨基酸等有效成分的分离，纯化和鉴定。例如，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白谱带数量，泳动率和着色深浅可对同种或同属外形相似的种子和果实类药材及易混药材进行鉴定。毛细管电泳能进行中药中核酸，蛋白质和多肽等成分的分析。
四：电泳技术使用的相关仪器
应用电泳技术时，需要使用一系列电泳仪器设备，包括电泳仪电源，电泳槽及配件和凝胶万象分析系统仪器设备。
电泳仪为电泳提供直流电源的装置，通过接通电源，加上电场来驱动带电分子的运动。电泳仪电源可控制电压和电流的输出大小，有的还可以设定时间。
电泳槽是电泳系统的核心部分，是分离样品的工作部位，主要由电极连接线，缓冲液槽和支持装置3部分构成。根据支持装置的形状不同可以分为圆盘电泳槽，垂直电泳槽和水平电泳槽等3种。一般实验室常用的是后两种。
垂直电泳槽常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块垂直放置的平行玻璃板，玻璃板两边由垫条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm×14xm，厚度为0.75~2mm.近年来新研制的电泳槽，胶面更小，更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。这样制备的凝胶冷却比较均匀，得到的分离区带平直，可以同时进行多个样品的分离，使实验结果具有可比性，电泳后的凝胶凝胶可以干燥保存或用于后续的分析鉴定，例如免疫印迹分析等。
水平电泳槽在制胶时凝胶被平铺在水平的制胶器上，然后将制备好的凝胶直接放在电泳槽的水平板上，倒入缓冲液，使凝胶直接浸入缓冲液中，这样的凝胶具有分辨率高，速度快，操作简便的特点。
凝胶成像分析系统是适用于电泳凝胶图像的分析研究的仪器设备。该仪器采用数码相机或模拟摄像头将置于暗箱内的电泳凝胶在紫外光，白光照射或透射下的影像取进计算机，通过相应的凝胶分析软件，可一性完成DNA RNA，蛋白质凝胶，薄层层析板等图像的分析，最终可得到凝胶条带的峰值，分子量或碱基对数，面积，高度，体积或样品总量等数据。
1： 仪器准备
准备好电泳仪，电泳槽和制胶器，打开电泳仪开关检查是否好用，再检查电泳槽，电泳槽摆放时负极放在左侧，并确定缓冲液没有超过电泳槽的指定线，将制胶器配件准备齐全。
2：制胶
根据样品数量选择合适的制胶和梳子，确定制备凝胶体积，利用电子天平称量琼脂糖，将秒好的琼脂放入三角烧瓶中，加入适量电泳缓冲液，用微波炉加热1~2min取出室温却到60℃左右；将透明托盘平行放入制胶器内，倒入适量琼脂糖凝胶，将具有所需齿数，厚度和数量的梳子插入制胶架的定位槽中，室温静置至凝胶凝固。
3： 样品准备和加样
在等待凝胶凝固的时候，进行样品的准备，确定上样量，并将样品和上样缓冲液按照一定比例混匀。待凝胶凝固后轻轻从一侧开始拔掉梳子，将凝胶托盘从制胶器中取出，移入电泳槽内，使凝胶全部被电泳缓冲液浸没高出胶面1~2mm，用微量移液器把混合好的样品加入样品孔内，并记录加样的顺序。
4：电泳
加样后，盖好电泳槽上盖，电泳槽的电极端插入电泳仪的输出电压孔内，电泳槽电极的红，黑线分别对应插入电泳仪的输出端子的红，黑插孔之中，要插入到底，使电极的金属部分完全进入输出端子的金属孔中，轻轻拨已插入的电极以确认连接牢固。打开电泳仪开关，电源指示灯亮，设置实验参数，根据实验需要，选择“功能/设定”键，用增大和减少设定电压，电流和时间。设置好实验参数后，按“输出/停止”按键，接通电源，开始电泳。
5：染色
经过电泳分离后的样品，一般在凝胶上不能直接观察到实验结果，还需要通过各种方法进行染色，根据样品不同选择特殊的染色液进行染色，例如核酸电泳通常使用溴化乙锭进行染色，蛋白质电泳常使用考马斯亮蓝等染色剂染色。
6： 电泳结果测定和分析
电泳结束后，使用凝胶成像分析系统进行电泳结果的检测和分析，通过相应的凝胶分析软件，可一次性完成DNA.RNA及蛋白质凝胶，薄层层析板等图像的分析，最终可得到凝胶条带的峰值，相对分子质量或碱基对数，面积，高度，位置，体积或样品总量。
三： 层析技术
层析法又称色谱法，是20世纪初由俄国植物学家M.Tstt所创立，是目前广泛应用的一种物理分离技术。层析系统由两个相组成：一个是固定相，另一个是流动相。所谓固定相是指固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相即为可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于混合物中各组分理化性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，亲和力，分配系数等）的不同，使各组分在固定相和流动相中分布比例不一样，移动速度不一致，从而达到将各组分分离的目的。层析技术具有分辨率高，灵敏度高，选择性好，速度快等特点，因此可以分离化学性质相似，难以用一定化学方法分离的化合物，尤其适用于生物迅猛的发展，目前已成为生物化学常用的分离分析技术之一。
按照原理和操作形式的不同，层析技术可分为吸附层析，分配层析，离子交换层析，凝胶过渡层析和亲和层析等。各种层析法见表2.虽然各种方法原理差异很大，但是其的基本操作步骤比较相似，包括选择适当吸附剂，加样，展开，检出鉴定四个环节。本节对于各种方法做一简要介绍。
（二）电转移
电转移目前应用非常广泛，是利用电场作用将核酸从凝胶转移到固相膜上。为了获得有效的印迹，电转移要在强电流下进行，但高强电流往往会产生过高的热量，必须采用冷却系统进行冷却，电印迹缓冲液以低离子强度为好。电印迹缓冲液里往往加入甲醇，甲醇的作用是使阴离子去污 剂(SDS)游离出来，增加NC膜的结合容量，提高NC膜与分子的结合力，防止凝胶肿胀。但是过多的甲醇能改变凝胶中大分子物质的电荷，使凝胶孔径缩小，影响转印的效率。印迹时间、电流 强度、凝胶的孔径等条件必须经过反复的摸索，采用适宜的条件才能得到比较好的效果。见图7。
(三)真空转移
真空转移法是转移缓冲液从上层容器通过凝胶和固相膜被抽到下层真空室内，同时带动凝胶 上的核酸片段从凝胶转移到固相膜上。该法具有简单、迅速、高效的特点。见图8。
四、常用的几种印迹方法
(一) Southerm印迹
Southern印迹将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，Southern 印迹是进行基因 组DNA特定序列定位的通用方法。DNA经限制性内切酶消化成片段后用琼脂糖凝胶电泳进行分 离，然后将凝胶上的DNA变性成单链并在原位将其转移至NC膜、尼龙膜或其他固相支持物上， 经干烤或者紫外线照射固定，再与具有特定标记的探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色， 检测特定DNA分子。
Southern印迹包括两个主要过程: -是印迹( blotting),即将待测核酸分子转移并结合到一 定的固相支持物占二是分子杂交，即固定于膜上的DNA同标记的探针在一定条件 下退火，缔合成双链。印迹方法目前除了虹吸法，现已发展为电转法、真空转移法等多种方法;滤膜常用的 有NC膜、尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。
Southerm印连基本步骤:①从组织中提取DNA:②用特定的核酸内切酶酶切:③琼脂糖凝胶 电泳;④碱变性;⑤中和反应;⑥转膜;⑦预杂交;⑧杂交;⑨杂交信号检制。
实验中应注意的问题:①转膜必须充分，要保证凝胶上的DNA已转到膜上:②杂交条件及 漂洗是保证阳性结果和条带与背景反差强烈的关键，如洗膜不充分会导致背景过高，而洗膜过度 可导致假阴性结果;③注意环保及安全。
利用 Southern印连法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某基因的定性及定量分
析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。
(二)Northerm印迹
Northerm印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。Northern 印迹 与Southerm印迹转膜方法相似，只是变性的方法不同: Northerm 印迹不用碱变性(因为NaOH会 水解RNA的2'-羟基)，在上样前用甲醛、乙二醛或甲基氢氧化银等使RNA变性，RNA变性后 有利于与膜结合。甲基氢氧化银是一种强力、可逆的变性剂，但是有毒，因而普遍采用甲醛作为 变性剂。高盐中转膜，低盐中洗脱，胶中不加溴化乙锭( EB )( EB会影响RNA与硝酸纤维索膜 的结合)。
Northern印迹基本步骤:①提取总RNA;②变性后进行琼脂糖凝胶电泳;③转膜;④固定;⑤杂交;⑥杂交值号检测, Northerm 印迹全过程所有操作均应避免RNA酶( Rnase )的污染。
(三) Western印进
Wetem印通技术是一种蛋白质的固定 和分析技术，是将蛋白质电泳，印迹、免疫测定险为 一体的特导性蛋户质的检测方法。 其原理是:先从样品中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白样品溶 于含休去污和和还原剂的溶液中，进行SDS-PAGE电泳，蛋白质按照相对分子质量的大小被分 离。然后将被分离的蛋白质原位转移到周相支持物(NC膜或尼龙膜等)上，将膜浸于高浓度的 蛋白质溶液中温育，使膜上未结合蛋白质的部分均结合上蛋白质而被封闭。加入特异性抗体(- 抗)进行孵育，膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合。-抗结合后再加入能与 抗特异性结合的 带标记的二抗，最后通过二抗上标记物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进 行检测，从而得知样品中目的蛋白的表达情况。
Westem印迹的基本步骤:①蛋白质样品制备;②SDS-PAGE电泳;③转膜;④封闭;⑤- 抗孵育;⑥二抗孵育;⑦显色;⑧对于显色结果进行分析。
Westerm印迹方法灵敏度高，通常可检测出50 ng的微量目的蛋白。
(四)斑点印迹
将样品点在支持膜上进行分子杂交的技术。如将核酸点在能与核酸结合的膜(如NC膜、尼龙膜等)上，经处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交。用放射自显影或非放射性显色检测，判断是否有杂交以及杂交强度，可作定性或半定量分析。斑点印迹主要用于基因缺 失或拷贝数改变的检测。常见的斑点杂交技术有DNA斑点杂交、RNA斑点杂交和完整细胞斑点 杂交等。该方法耗时短，一-张膜上可同时检测多个样品。
斑点印迹的基本步骤:①膜预处理;②点样;③预杂交;④杂交;⑤加抗体;⑥显色。
光是一种电磁波，当光通过透明溶液介质时，部分光会被吸收，这种光被溶液吸收的现象可用于某些物质的定性及定量的测定。利用物质具有特征性的吸收光谱，测定被测物质溶液在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对其进行定性和定量分析的方法称为分光光度法。发光光度法在医药研究、环境监测、农业等各领域都有十分广泛的应用，可进行定性分析、定量分析、纯度分析和结构分析。在医药研究中，主要用于临床分析、疾控分析、生物领域的微量样品测定、人体生物指标分析、代谢产物分析和药品分析等。
1：分光光度技术的基本原理
光是由光子组成的，光线是高速运动的光子流。和其他电滋波一样，传播性质呈波动性质，有波长和频率的特征。光子的能量与频率成正比，与波长成反比。其中波长390-780nm的光为可见光，波长10-400nm的为紫外光，波长760-1mm的为红外光。具有同一波长的光称为单色光，具有不同波长的光称为复合光。当一束光通过某物质溶液时，如果溶液不吸收其中的光，则呈无色透明，如果溶液能够吸收某波长的光，则呈现出被吸收光的互补色。有的溶液能够吸收紫外光，比如核酸和蛋白质溶液。
分光光度技术能够进行物质的定量分析，其依据的基本原理是Lambert-Beer定律。该定律阐明了溶液对单色光吸收的程度与溶液的浓度及液层厚度之间的定量关系。
当一束平行的单色光通过某有色溶液时，一部分光被吸收，一部分则透过该溶液，一部分被比色皿表面反射。在测定时，由于采用相同质地的比色皿，反射光的强度基本相同，所以其以不予考虑。
设光原来的强度即入射光强度为Io，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，则I0=Ia+Ito，透射光强度与入射光强度之比表示光线透过溶液的程度，被称为透光度(transmittance)，用T表示：
T=It/Io
透光度越大，溶液对光的吸收程度越小，反之，透光度越小，溶液对光的吸收程度越大。透光度的负对数称为吸光度(absorbance)，用A表示，亦称光密度(optical density,OD)。用T表示：
A=1g(1/T)
溶液对光的吸收程度除了与溶液本身的性质有关外，还与入射的光波长、溶液的浓度、液层的厚度及温度等有关。
二. 电泳技术
电泳是指带电颗粒在电场中移动的现象。很多重要的生物分子，如蛋白质，核酸，氨基酸，核苷酸等，都具有要以解离的基团，在溶液中能够形成带电荷的颗粒，因而在电场的作用下会发生移动，各种分子的结构，性质，大小，形状及其所带净电荷的多少不同， 在电场中移动的速度不同， 因此通过电泳能够将混合物中的各种保姆妈妈根据大小，形状和电荷多少不同而分离开。因电泳技术具有操作简便，速度较快，实验设备要求不高的特点，已经成为生物技术实验的一项基本技术。电泳实验时需要使用的仪器包括电泳仪电源，电泳槽和配件及凝胶成像分析系统等。
一： 电泳技术的基本原理
由于不同物质带电性质不同， 因而在一定地电场强度下的移动速度不同。不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。即
式中：u为迁移率；
v为颗粒的泳动速度（cm/s或cm/min)；E为电场强度或电势梯度（V/cm);d为颗粒泳动距离（cm); l为支持物的有效长度（cm); v为加在支持物两端的实际电压（V）；l为通过时间（s或min ). 通过测量d,l,v,t便可计算出颗粒的迁移率。在电泳过程中，带电粒子的移动速度v除与粒子所带电荷量Q及电场强度E 有关外，还与粒子半径r及介质的黏度n有关：
π是适用于球形带电粒子的经验数值，对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不同。可见，带电粒子的移动速度和粒子的本身的性质有密切关系，粒子表面所带电荷量和物质的组成结构有密切关系，此外，粒子的在小（相对分子质量）及粒子的形状了有重要的影响。所以，在一定的电强度下，不同种类的带电物质在电泳时的移动速度就不能完全一致，这种移动速度的差异就是电泳技术的基本依据。
迁移率会受到三种因素的影响：1 带电颗粒本身的性质，如颗粒所带净电荷量，颗粒的大小和颗粒的形状等因素。一般来说，颗粒带净电荷量多，颗粒直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快，形成依次排列的不同区带而被分开，即使两个分子具有相似的电荷，如果分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移率也不同，在电泳过程中可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。2 带电颗粒所处的环境的影响，包括缓冲液的浓度，PH，离子强度和温度等因素。例如，离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢。3 电场的强度，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度正比。
二：常用的电泳方法
电泳可分为无支持介质的自由电泳和有固定支持介质的区带电泳两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳，显微电泳，等电聚焦电泳，等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括虑纸电泳，薄层电泳，凝胶电泳等。现在一般实验室常规电泳过程都是在一种固定支持介质中进行的，属于固定支持介质的区带电泳。目前使用最多的固定支持介质是凝胶，凝胶的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术的操作变得十分简便，分辨率较高，因此电泳技术成为蛋白质，核酸等生物大分子分析的重要手段之一。目前使用最多的凝胶是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰氨凝胶。
1：醋酸纤维薄膜电泳
采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维薄膜电泳，醋酸纤维是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮，氯仿，氯乙烯，乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后成为醋酸纤维膜。醋酸纤维一种良好的金牛支持物， 具有电泳速度快，电渗现象小，对样品吸附小及经透明处理后标本可以长期保存等优点。
2：琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳。凝胶糖凝胶具有多孔网状结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子小，体现为“分子筛”和“电泳”双重作用，大大地提高了分辨能力。
琼脂糖凝胶通常制成板状，凝胶浓度以0.8%~1.0%为宜，在此浓度下，制成的凝胶富有弹性，坚固而不脆。在制作的过程中，应避免长时间加热。
琼脂糖凝胶电泳具有较高分辨率，重复性好，区带易染色，洗脱和定量，以及干膜可以长时间保存等优点。因此，广泛用于大分子物质如蛋白质，核酸等的分离分析。
3：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳，该凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳也具有“分子筛”和“电泳”双重作用，具有更高的分辨能力。一般来说，纸电泳仅能将血清蛋白分成5~7个组分，而聚丙烯酰胺凝胶电泳则可分为20~30个组分。目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛用于蛋白质，核酸等生物大分子的分离鉴定和分子量的测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲液，PH和凝胶孔径都是相同的，而后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，PH和凝胶孔径等。不连续电泳除具有“分子筛”和“电泳”双重作用外，尚具有浓缩效应，可将样品在分离前浓缩成层，从而提高分辨能力。
三：电泳技术的应用
电泳技术在基础研究中的应用
电泳技术主要用于分离和纯化氨基酸，多肽，蛋白质，脂类，核苷酸，核酸等各种和机物；也可用于DNA的测序，物质纯度和分子质量的测定等。电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。
电泳技术在临床疾病诊断中的应用
在临床疾病诊断中，电泳技术被用于血清蛋白，尿蛋白，脂蛋白，同工酶的分离和鉴定进行肾，肝和心脏等疾病的诊断。为各种相关疾病的诊断，鉴别诊断，疗效观察及判断预后提供了方便。
电泳技术在中药鉴定中的应用
电泳技术可用于中药中的生物碱，多糖，有机酸和氨基酸等有效成分的分离，纯化和鉴定。例如，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白谱带数量，泳动率和着色深浅可对同种或同属外形相似的种子和果实类药材及易混药材进行鉴定。毛细管电泳能进行中药中核酸，蛋白质和多肽等成分的分析。
四：电泳技术使用的相关仪器
应用电泳技术时，需要使用一系列电泳仪器设备，包括电泳仪电源，电泳槽及配件和凝胶万象分析系统仪器设备。
电泳仪为电泳提供直流电源的装置，通过接通电源，加上电场来驱动带电分子的运动。电泳仪电源可控制电压和电流的输出大小，有的还可以设定时间。
电泳槽是电泳系统的核心部分，是分离样品的工作部位，主要由电极连接线，缓冲液槽和支持装置3部分构成。根据支持装置的形状不同可以分为圆盘电泳槽，垂直电泳槽和水平电泳槽等3种。一般实验室常用的是后两种。
垂直电泳槽常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块垂直放置的平行玻璃板，玻璃板两边由垫条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm×14xm，厚度为0.75~2mm.近年来新研制的电泳槽，胶面更小，更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。这样制备的凝胶冷却比较均匀，得到的分离区带平直，可以同时进行多个样品的分离，使实验结果具有可比性，电泳后的凝胶凝胶可以干燥保存或用于后续的分析鉴定，例如免疫印迹分析等。
水平电泳槽在制胶时凝胶被平铺在水平的制胶器上，然后将制备好的凝胶直接放在电泳槽的水平板上，倒入缓冲液，使凝胶直接浸入缓冲液中，这样的凝胶具有分辨率高，速度快，操作简便的特点。
凝胶成像分析系统是适用于电泳凝胶图像的分析研究的仪器设备。该仪器采用数码相机或模拟摄像头将置于暗箱内的电泳凝胶在紫外光，白光照射或透射下的影像取进计算机，通过相应的凝胶分析软件，可一性完成DNA RNA，蛋白质凝胶，薄层层析板等图像的分析，最终可得到凝胶条带的峰值，分子量或碱基对数，面积，高度，体积或样品总量等数据。
五： 电泳的基本操作方法
琼脂糖凝胶电泳操作比较简便，在实验室中较为常用，因此本节以琼脂糖凝胶电泳为例介绍电泳的基本操作方法。电泳操作时，一般分为仪器准备，制胶，样品准备和加样，电泳，染色，电泳结果测定和分析等操作步骤。1： 仪器准备
准备好电泳仪，电泳槽和制胶器，打开电泳仪开关检查是否好用，再检查电泳槽，电泳槽摆放时负极放在左侧，并确定缓冲液没有超过电泳槽的指定线，将制胶器配件准备齐全。
2：制胶
根据样品数量选择合适的制胶和梳子，确定制备凝胶体积，利用电子天平称量琼脂糖，将秒好的琼脂放入三角烧瓶中，加入适量电泳缓冲液，用微波炉加热1~2min取出室温却到60℃左右；将透明托盘平行放入制胶器内，倒入适量琼脂糖凝胶，将具有所需齿数，厚度和数量的梳子插入制胶架的定位槽中，室温静置至凝胶凝固。
3： 样品准备和加样
在等待凝胶凝固的时候，进行样品的准备，确定上样量，并将样品和上样缓冲液按照一定比例混匀。待凝胶凝固后轻轻从一侧开始拔掉梳子，将凝胶托盘从制胶器中取出，移入电泳槽内，使凝胶全部被电泳缓冲液浸没高出胶面1~2mm，用微量移液器把混合好的样品加入样品孔内，并记录加样的顺序。
4：电泳
加样后，盖好电泳槽上盖，电泳槽的电极端插入电泳仪的输出电压孔内，电泳槽电极的红，黑线分别对应插入电泳仪的输出端子的红，黑插孔之中，要插入到底，使电极的金属部分完全进入输出端子的金属孔中，轻轻拨已插入的电极以确认连接牢固。打开电泳仪开关，电源指示灯亮，设置实验参数，根据实验需要，选择“功能/设定”键，用增大和减少设定电压，电流和时间。设置好实验参数后，按“输出/停止”按键，接通电源，开始电泳。
5：染色
经过电泳分离后的样品，一般在凝胶上不能直接观察到实验结果，还需要通过各种方法进行染色，根据样品不同选择特殊的染色液进行染色，例如核酸电泳通常使用溴化乙锭进行染色，蛋白质电泳常使用考马斯亮蓝等染色剂染色。
6： 电泳结果测定和分析
电泳结束后，使用凝胶成像分析系统进行电泳结果的检测和分析，通过相应的凝胶分析软件，可一次性完成DNA.RNA及蛋白质凝胶，薄层层析板等图像的分析，最终可得到凝胶条带的峰值，相对分子质量或碱基对数，面积，高度，位置，体积或样品总量。
三： 层析技术
层析法又称色谱法，是20世纪初由俄国植物学家M.Tstt所创立，是目前广泛应用的一种物理分离技术。层析系统由两个相组成：一个是固定相，另一个是流动相。所谓固定相是指固体物质或者是固定于固体物质上的成分；流动相即为可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于混合物中各组分理化性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，亲和力，分配系数等）的不同，使各组分在固定相和流动相中分布比例不一样，移动速度不一致，从而达到将各组分分离的目的。层析技术具有分辨率高，灵敏度高，选择性好，速度快等特点，因此可以分离化学性质相似，难以用一定化学方法分离的化合物，尤其适用于生物迅猛的发展，目前已成为生物化学常用的分离分析技术之一。
按照原理和操作形式的不同，层析技术可分为吸附层析，分配层析，离子交换层析，凝胶过渡层析和亲和层析等。各种层析法见表2.虽然各种方法原理差异很大，但是其的基本操作步骤比较相似，包括选择适当吸附剂，加样，展开，检出鉴定四个环节。本节对于各种方法做一简要介绍。
下表为种层析法原理
一：吸附层析
吸附层析是1906年M.Tswtt所创立的层析方法，其最初用来研究植物色素，并证明植物叶子中除了叶绿素外还有其他色素。该法固定相是固体吸附剂，各组分在吸附剂表面的吸附能力不同从而达到分离的目的。
吸附是指某些物质溶液中的溶质集在其表面的现象，该物质即为吸附剂，在吸附层析中一般用固体吸附剂；被吸附到吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂和被吸附物之间的相互作用主要有离子吸引，疏水作用，范德华力和氢键等，吸附作用是可逆的，即在一定条件下，被吸附物可被吸附到吸附剂的表面，如果条件改变，如改变流动相溶液成分等，被吸附物可以离开吸附剂表面，称为解吸作用，吸附层析中用洗脱液洗脱进行解吸。这样，通过反复的吸附一解一吸一再吸附一再解吸过程，达到分离纯化的目的。
选择吸附的主要原则：
在流动相溶液剂中不溶解，对洗脱系统及层析分离的物质呈化学惰性;
在保证吸附可逆性的同时，具有很高的吸附能力；
分子扩散平衡速度应尽可能地快。
目前应用比较广泛的吸附剂有氯化铝，硅胶，活性炭，羟基磷灰石，聚酰胺等。
吸附层析主要有柱层析和薄层层析两种。
（一）柱层析
制备层析柱
准备一根适当尺寸的细长玻璃管，管的下端近于封闭而只留下一细小的出口，并在管的底部铺垫细孔尼龙网，玻璃棉，垂熔滤板或其他适当的细孔滤器，以保证柱内固定相不致流失。将吸附剂填入柱内，注意避免产生气泡。
加样
将欲分离的混合溶液自柱顶加进吸附层析柱，此时，各组分全被吸附在柱的上层。
洗脱
加样后各组分全被吸附在柱的上层，加入洗脱液进行解吸洗脱。一般情况下，溶解样品的溶剂极性较弱，使化妆品易被吸附于固定相上；而洗脱液极性较强，易使样品中各组分从固定相上被洗脱下来。样品被洗脱下来后向下移动，当遇到新的吸附剂颗粒时，又被从溶液中吸附出来，流下的新洗脱剂再次将它解吸继续向下移动，接着再被下方的吸附剂吸附。如此吸附一解吸一再吸附反复进行，经过一段时间以后，样品中的组分均向下移动一段距离，此距离长短与吸附剂对组分的吸附力强而解吸力弱的组分，其移动距离小。经过一定时间，各组分在柱内形成各自的区带。倘若被分离的组分有颜色，在层析柱内可看到清晰的色带，如果被分离的组分没有颜色，可以采用紫外线或者适当的显色剂进行观察定位。也可以将被分离的组分分别进行洗脱收集，进行定性，定量检测。以洗脱液体积对被洗脱组分浓度关系作图，则可以得到洗脱曲线。
洗脱方法主要有三种：溶剂洗脱法，置换洗脱法和前线洗脱法。
（1）溶剂洗脱法：洗脱剂为单一或者混合的溶剂。加样后，连续不断地加入洗脱剂，样品中的各组分则按照吸附力由弱到强的顺序先后洗脱出来。分别收集各组分就可达到分离的目的。也可以采用梯度洗脱法。即用PH梯度洗脱液或浓度梯度洗脱液进行脱法。
（2）置换洗脱法：洗脱剂为置换洗脱液，其中含有置换剂，与固定相之间的吸附力比被吸附的样品组分更强。当用置换洗脱液冲洗层析柱时， 置换剂取代了原来被吸附的样品组分的位置，序先后流出。分别收集各组分就可以达到分离的目的。
（3）前线洗脱法：所用的洗脱剂为含有各组分的样品溶液本身。连续向层析柱内加入样品混合溶液至一定体积后，层析柱内的吸附剂达到饱和状态，吸附力组分开始流出，随后样品液中的各组分按照吸附力由弱到强的顺序，先后以两组分，三组分，多组分的混合液形式流出。此法可将最前线的组分即吸附力最弱的组分与其他分离。
薄层层析
薄层层析是在支持板（一般用玻璃板）上将作为固定相的支持剂均匀涂布形成薄层，将待分离的样品混合物占到薄层板一端，然后选择合适的展开剂进行展开，从而达到使各组分分离的目的。
基本操作步骤如下;
薄层的制作
用涂布或者手动在薄层板上涂铺上一层固定相支持物。要求薄厚均匀，避免产生气泡，晾干待用。
点样
将样品混合物点在薄层的一端。
展开
在密闭的器皿中使用展开剂进行展开。
定位
用适当的显色剂喷雾或根据各组分的紫外吸附特性进行定位。若有放射性物质存在可用扫描进行定位。
薄层层析涉及的设备较少，操作简便且快速灵敏。若改变薄层厚度，既可做分析鉴定，又可进行少量分离提纯。配合应用薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析。因此生物化学，植物化学等领域应用广泛。
分配层析
分配层析是马丁和辛格在1941年发明的，利用待分离的各组分在两项中分配系数不同而进行的一种物质分离方法。当一种溶质在互不相溶剂中分配时， 在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为常数，即分配系数。分配系数与溶质，固定相，流动相的性质有关，同时，受温度，压力等条件的影响，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有明显的差异，即可被分离。
分配层析中，固定相通常是被结合于固体惰性支持物（如滤纸，硅藻土，纤维素等）上的水，流动相由有机溶剂构成。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。
离子交换层析
离子交换层析是以含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质——离子交换剂————为固定相， 依据流动相中各组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子盗抢层析生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛地应用于氨基酸，蛋白质，糖类，核苷酸等的分离纯化。
离子交换层析柱中装有离子交换剂，目前常用的离子交换剂有；离子交换纤维素，离子交换葡聚糖和离子交换树脂。当待分离的离子混合液流经层析柱时，各种组分不同程度地被吸附到固定相上。在一定条件下某种组分离子交换剂上的浓度与其在溶液中的浓度达到平衡时二者浓度的比值称为平衡常数（K）。K值反映了离子交换剂上的活性基团与组分离子的亲和力就越大，因此，该组分离子就越容离子的K值差异较大，则通过离子交换层析可将这些组分分离开来。
离子交换层析操作过程一般包括装柱，上柱，洗脱，收集和交换剂再生等步骤。
装柱
有干法装柱和湿法装柱两种。干法装柱是将干燥的离子交换剂边振荡边缓慢均匀倒入层析柱内，慢慢加入适当的溶剂或溶液进行溶胀沉降成柱。注意避免柱内产生气泡或裂纹影响分离效果。
湿法装柱是在柱内预先装入一定体积的溶剂或溶液，将离子交换剂与溶剂或溶液混合在一起，边搅拌边倒入垂直的层析柱内，让离子交换剂慢慢自然沉降，离子交换剂柱同样要注意均匀，无气泡，无裂缝产生。
上柱
装柱完成后，将欲分离的混合溶液加入到离子交换柱中，即上柱。一柱时要注意混合溶液的温度，PH和离子浓度等条件及流速。
洗脱和收集
采用含有与离子交换剂亲和力较大的洗脱液进行洗脱。吸附在离子交换剂上的各组分离子就按照与交换剂亲和力由小到大的顺序逐次被交换洗脱下来，分别收集洗脱即可分离各组分。对于含有多种组分的某些混合液可以采用梯度洗脱进行洗脱以达到更好的分离效果。
再生
离子交换剂可重复使用。洗脱后，可以用酸或碱处理离子交换剂使其恢复原状。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析又称凝胶排阻层析，分子排阻层析或分子筛层析，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。是使存在于流动相中的各种不同相对分子质量的组分流过具有分子筛性质的多孔凝胶形成的固定相，从而将各种组分分离的一种层析技术。其原理是：层析柱中的固定相是某些惰性的多孔网状结构凝胶（如交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯）。当含有各组分的混合溶液流经固定相时，相对分子质外，使小分子组分流下时路程较长，向下移动的速度较慢；而大分子物质却无法进入凝胶颗粒的微孔内，只能顺着凝胶颗粒的间隙向下流动，因此流程短，下来的速度就快，先流出层析柱。当某一混合溶液通过凝胶过滤层析时，溶液中的物质按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，从而达到分离的目的。
以下简要介绍凝胶过滤层析的基本过程。
凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。1组别分离：对于混合样品中的大分子物质和小分子物质进行分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50；2小肽和相对分子质量低的物质（1000-5000）的脱盐，可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4；3分级分离是指将样品中一些相结分子质量比较相近的物质进行分离，一般选用排阻限度略大于样品中相对分子质量最高的物质的凝胶。层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于
不同，得到分离。
层析柱长度和直径的选择
一般来说，组别分离时，采用2-30cm长的层析柱；分级分离时，采用100cm左右的层析柱，其直径为1-5cm （小于1cm易产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重）。长度L与直径D的比值（L/D）最好在7-10之间，但对移动较慢的物质，L/D为30-40.
装柱
将层析柱垂直固定于架上，下端流出口用夹子紧，柱内先充满洗脱液，一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮游（将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中使其充分溶胀，可加热提高其溶胀速度。溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去即得到凝胶悬浮液）。凝胶自然下沉于柱内，直至达到所需的高度，将洗脱液浸过凝胶表面，以免混入空气。稍放置一段时间，进行流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。平衡过程中逐渐增加至层析时的流速，但不能超过层析时的最终流速。平衡凝胶柱过夜。使用前要检查层析柱是否分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。可加一些有色物质进行检验，观察色带的移动，性能良好的层析柱色带狭窄，均匀平整，若色带歪曲，散乱，变宽则必须重新装柱。
上柱
洗脱液液面恰好与凝胶床的表面位于同一平面时加入样品混合液。样品混合液体积通常为凝胶床体积的5%-10%，不能超过30%。样品加入后打开流出口，使样品渗入到凝胶床内。
洗脱
当样品液面恰与凝胶床表面相平时，加进约为凝胶床体积120%的洗脱液进行洗脱，分部收集洗脱液即可分离各组分。
凝胶过滤层析对于高分子物质有很好的分离效果，所用的凝胶属惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，因此对所分离组分的理化性质的保持具有较好的优势，目前在生物化学实验中广泛应用。
亲和层析
某些生物分子的特定结构部位能够同其他生物子的相应结构识别并结合，如受体与配体的识别结合，酶与低物的识别结合等，这种结合是特异的，可逆的，改变条件可以解除这种结合。生物分子间的这种结合能力叫做亲和力。亲和层析就是根据该原理设计的物质分离纯化方法。
亲和层析是利用分子与其配体间专一可逆的结合作用进行物质分离的技术。其专一性，选择性高，通过一次亲和层析操作，可把目的组分从混合物中分离出来，尤其对含量甚微组分的分离具有良好的效果。此法具有高效，快速，简便等优点。亲和层析中，将可亲和的一对分子之一以共价键连接到不溶性载体上，成为固定相。当样品混合物流经此固定相时，只有和固定相分子有相流出，然后用洗脱液将结合的亲和物洗脱下来。
在亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称为配基。可以作为基质的有玻璃球，石英微球，氧化铝，聚丙烯酰胺凝胶，葡聚糖凝胶，纤维素和琼脂糖等。以琼脂糖最为常用。配基的固定化方法有多种，包括物理吸附法，载体结合法，包埋法和交联法等四类。以下简要介绍亲和层析的基本扣件过程。
（1）选择能被待分离的目的分子（配体）识别并可逆结合配基。
（2）把配基共价结合到基质上，即配基的固定化。
（3）把基质-配基复合物灌装在层析柱内做成亲和柱。
（4）上样亲和→洗涤杂质→洗脱收集配体→亲和柱再生。
亲和层析实验条件温和，过程简单，反应迅速，分离效率高，可避免一些不稳定的物质在纯化过程中的变性失活。但是分离某种物质需要制备相应的特异性层析柱和建立相应的实验条件，配基的选择及其固定化操作比较繁琐，因此其应用受到一定限制。高效亲和层析，具有高特异性和高速性的特点，可与高效液相层析技术配合使用，加大分析浓度，该技术将在未来的生物化学实验中发挥更大的作用。
印迹技术
将各种生物大分子(核酸、蛋白质等)从凝胶转移到种固定基质上的过程称为印迹技术。1975年英国人Southerm首先提出了分子印迹的概念。他首先将不同长度片段DNA分子进行琼脂 糖凝胶电泳，并在凝胶中变性使其成为单链，然后将-张硝酸纤维素 (NC)膜放在凝胶上，NC 膜上放有吸水纸巾，由于虹吸原理，凝胶中的DNA片段转移到NC膜上，成为固相化分子。将 载有DNA单链分子的NC膜置于杂交液与带有标记的探针(DNA或RNA分子)进行杂交，具 有互补序列的探针结合到存在于NC膜上的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术显现出 杂交分子的区带。类似于用吸墨纸吸取纸张上的墨迹，因此称为“botting", 译为印迹技术。1977 年，在Southerm blotting的基础上，Alwine 进行改进，用以研究RNA,将其诙谐地称为Northem blotting; 1979 年，Towbin 建立Westerm blotting,即蛋白印迹，也叫免疫印迹。在过去的几十年 中，生物大分子印迹技术迅猛发展，已广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测。目前印迹技术主要 有Southem印迹( Southern blotting )、Northerm 印迹( Northerm blotting )、Western 印迹(Westem boting)以及斑点印迹(Dot botting)等。
一、生物大分子凝胶电泳分离
印迹的第一步是将生物大分子按其相对分子质量的大小进行凝胶电泳分离。通常情况下， DNA印迹首先将DNA分子用限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，由于双链DNA不能结 合到NC膜上，因此电泳后需碱处理凝胶，使DNA变性成单链结构; RNA印迹与DNA相似， 由于碱会使RNA降解，故不能用碱变性;蛋白印迹通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。
二、固相支持物的选择
由于凝胶易碎、易扩散，很难对其进行处理以检测目的条带，因此，需要把凝胶上的分子条 带转移并固定到固相支持物上，形成稳定、容易被检出的固定化生物大分子。目前常用的固相支 持物有NC膜、尼龙膜等，与生物大分子非共价结合。NC膜较便宜，结合容量大，因而广泛应 用。尼龙膜对于生物大分子的结合容量更大，在印迹时，生物大分子不易穿过膜造成损失，但背 景较高。NC膜不能用于RNA印迹，尼龙膜对于DNA、RNA结合能力均较强，可以重复使用， 因此DNA、RNA印迹常用尼龙膜。
三、转移
印迹的方法目前主要有毛细管虹吸转移、电转移和真空转移。
(一)毛细管虹吸转移
毛细管虹吸转移是利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相膜上。该法不需要专门设备，操作简单，重复性好。核酸分子 转移的速度取决于核酸分子的大小及凝胶的浓度 和厚度，核酸分子越小、凝胶浓度越低、凝胶厚 度越薄，转移速度越快。毛细管虹吸转移需要的 时间较长，不适合用于小孔径凝胶上分子的转移。
吸附层析是1906年M.Tswtt所创立的层析方法，其最初用来研究植物色素，并证明植物叶子中除了叶绿素外还有其他色素。该法固定相是固体吸附剂，各组分在吸附剂表面的吸附能力不同从而达到分离的目的。
吸附是指某些物质溶液中的溶质集在其表面的现象，该物质即为吸附剂，在吸附层析中一般用固体吸附剂；被吸附到吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂和被吸附物之间的相互作用主要有离子吸引，疏水作用，范德华力和氢键等，吸附作用是可逆的，即在一定条件下，被吸附物可被吸附到吸附剂的表面，如果条件改变，如改变流动相溶液成分等，被吸附物可以离开吸附剂表面，称为解吸作用，吸附层析中用洗脱液洗脱进行解吸。这样，通过反复的吸附一解一吸一再吸附一再解吸过程，达到分离纯化的目的。
选择吸附的主要原则：
在流动相溶液剂中不溶解，对洗脱系统及层析分离的物质呈化学惰性;
在保证吸附可逆性的同时，具有很高的吸附能力；
分子扩散平衡速度应尽可能地快。
目前应用比较广泛的吸附剂有氯化铝，硅胶，活性炭，羟基磷灰石，聚酰胺等。
吸附层析主要有柱层析和薄层层析两种。
（一）柱层析
制备层析柱
准备一根适当尺寸的细长玻璃管，管的下端近于封闭而只留下一细小的出口，并在管的底部铺垫细孔尼龙网，玻璃棉，垂熔滤板或其他适当的细孔滤器，以保证柱内固定相不致流失。将吸附剂填入柱内，注意避免产生气泡。
加样
将欲分离的混合溶液自柱顶加进吸附层析柱，此时，各组分全被吸附在柱的上层。
洗脱
加样后各组分全被吸附在柱的上层，加入洗脱液进行解吸洗脱。一般情况下，溶解样品的溶剂极性较弱，使化妆品易被吸附于固定相上；而洗脱液极性较强，易使样品中各组分从固定相上被洗脱下来。样品被洗脱下来后向下移动，当遇到新的吸附剂颗粒时，又被从溶液中吸附出来，流下的新洗脱剂再次将它解吸继续向下移动，接着再被下方的吸附剂吸附。如此吸附一解吸一再吸附反复进行，经过一段时间以后，样品中的组分均向下移动一段距离，此距离长短与吸附剂对组分的吸附力强而解吸力弱的组分，其移动距离小。经过一定时间，各组分在柱内形成各自的区带。倘若被分离的组分有颜色，在层析柱内可看到清晰的色带，如果被分离的组分没有颜色，可以采用紫外线或者适当的显色剂进行观察定位。也可以将被分离的组分分别进行洗脱收集，进行定性，定量检测。以洗脱液体积对被洗脱组分浓度关系作图，则可以得到洗脱曲线。
洗脱方法主要有三种：溶剂洗脱法，置换洗脱法和前线洗脱法。
（1）溶剂洗脱法：洗脱剂为单一或者混合的溶剂。加样后，连续不断地加入洗脱剂，样品中的各组分则按照吸附力由弱到强的顺序先后洗脱出来。分别收集各组分就可达到分离的目的。也可以采用梯度洗脱法。即用PH梯度洗脱液或浓度梯度洗脱液进行脱法。
（2）置换洗脱法：洗脱剂为置换洗脱液，其中含有置换剂，与固定相之间的吸附力比被吸附的样品组分更强。当用置换洗脱液冲洗层析柱时， 置换剂取代了原来被吸附的样品组分的位置，序先后流出。分别收集各组分就可以达到分离的目的。
（3）前线洗脱法：所用的洗脱剂为含有各组分的样品溶液本身。连续向层析柱内加入样品混合溶液至一定体积后，层析柱内的吸附剂达到饱和状态，吸附力组分开始流出，随后样品液中的各组分按照吸附力由弱到强的顺序，先后以两组分，三组分，多组分的混合液形式流出。此法可将最前线的组分即吸附力最弱的组分与其他分离。
薄层层析
薄层层析是在支持板（一般用玻璃板）上将作为固定相的支持剂均匀涂布形成薄层，将待分离的样品混合物占到薄层板一端，然后选择合适的展开剂进行展开，从而达到使各组分分离的目的。
基本操作步骤如下;
薄层的制作
用涂布或者手动在薄层板上涂铺上一层固定相支持物。要求薄厚均匀，避免产生气泡，晾干待用。
点样
将样品混合物点在薄层的一端。
展开
在密闭的器皿中使用展开剂进行展开。
定位
用适当的显色剂喷雾或根据各组分的紫外吸附特性进行定位。若有放射性物质存在可用扫描进行定位。
薄层层析涉及的设备较少，操作简便且快速灵敏。若改变薄层厚度，既可做分析鉴定，又可进行少量分离提纯。配合应用薄层扫描仪，可以同时做到定性定量分析。因此生物化学，植物化学等领域应用广泛。
分配层析
分配层析是马丁和辛格在1941年发明的，利用待分离的各组分在两项中分配系数不同而进行的一种物质分离方法。当一种溶质在互不相溶剂中分配时， 在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为常数，即分配系数。分配系数与溶质，固定相，流动相的性质有关，同时，受温度，压力等条件的影响，如果某一混合物的各组分在这两相中的分配系数有明显的差异，即可被分离。
分配层析中，固定相通常是被结合于固体惰性支持物（如滤纸，硅藻土，纤维素等）上的水，流动相由有机溶剂构成。当某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。
离子交换层析
离子交换层析是以含有能与周围介质进行离子交换的不稳定离子的不溶性基质——离子交换剂————为固定相， 依据流动相中各组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子盗抢层析生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛地应用于氨基酸，蛋白质，糖类，核苷酸等的分离纯化。
离子交换层析柱中装有离子交换剂，目前常用的离子交换剂有；离子交换纤维素，离子交换葡聚糖和离子交换树脂。当待分离的离子混合液流经层析柱时，各种组分不同程度地被吸附到固定相上。在一定条件下某种组分离子交换剂上的浓度与其在溶液中的浓度达到平衡时二者浓度的比值称为平衡常数（K）。K值反映了离子交换剂上的活性基团与组分离子的亲和力就越大，因此，该组分离子就越容离子的K值差异较大，则通过离子交换层析可将这些组分分离开来。
离子交换层析操作过程一般包括装柱，上柱，洗脱，收集和交换剂再生等步骤。
装柱
有干法装柱和湿法装柱两种。干法装柱是将干燥的离子交换剂边振荡边缓慢均匀倒入层析柱内，慢慢加入适当的溶剂或溶液进行溶胀沉降成柱。注意避免柱内产生气泡或裂纹影响分离效果。
湿法装柱是在柱内预先装入一定体积的溶剂或溶液，将离子交换剂与溶剂或溶液混合在一起，边搅拌边倒入垂直的层析柱内，让离子交换剂慢慢自然沉降，离子交换剂柱同样要注意均匀，无气泡，无裂缝产生。
上柱
装柱完成后，将欲分离的混合溶液加入到离子交换柱中，即上柱。一柱时要注意混合溶液的温度，PH和离子浓度等条件及流速。
洗脱和收集
采用含有与离子交换剂亲和力较大的洗脱液进行洗脱。吸附在离子交换剂上的各组分离子就按照与交换剂亲和力由小到大的顺序逐次被交换洗脱下来，分别收集洗脱即可分离各组分。对于含有多种组分的某些混合液可以采用梯度洗脱进行洗脱以达到更好的分离效果。
再生
离子交换剂可重复使用。洗脱后，可以用酸或碱处理离子交换剂使其恢复原状。
凝胶过滤层析
凝胶过滤层析又称凝胶排阻层析，分子排阻层析或分子筛层析，是20世纪60年代发展起来的一种简便有效的生物化学分离分析方法。是使存在于流动相中的各种不同相对分子质量的组分流过具有分子筛性质的多孔凝胶形成的固定相，从而将各种组分分离的一种层析技术。其原理是：层析柱中的固定相是某些惰性的多孔网状结构凝胶（如交联葡聚糖，交联琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖，多孔玻璃，聚苯乙烯）。当含有各组分的混合溶液流经固定相时，相对分子质外，使小分子组分流下时路程较长，向下移动的速度较慢；而大分子物质却无法进入凝胶颗粒的微孔内，只能顺着凝胶颗粒的间隙向下流动，因此流程短，下来的速度就快，先流出层析柱。当某一混合溶液通过凝胶过滤层析时，溶液中的物质按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，从而达到分离的目的。
以下简要介绍凝胶过滤层析的基本过程。
凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。1组别分离：对于混合样品中的大分子物质和小分子物质进行分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50；2小肽和相对分子质量低的物质（1000-5000）的脱盐，可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4；3分级分离是指将样品中一些相结分子质量比较相近的物质进行分离，一般选用排阻限度略大于样品中相对分子质量最高的物质的凝胶。层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于
不同，得到分离。层析柱长度和直径的选择
一般来说，组别分离时，采用2-30cm长的层析柱；分级分离时，采用100cm左右的层析柱，其直径为1-5cm （小于1cm易产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重）。长度L与直径D的比值（L/D）最好在7-10之间，但对移动较慢的物质，L/D为30-40.
装柱
将层析柱垂直固定于架上，下端流出口用夹子紧，柱内先充满洗脱液，一边搅拌一边缓慢而连续地加入浓稠的凝胶悬浮游（将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中使其充分溶胀，可加热提高其溶胀速度。溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去即得到凝胶悬浮液）。凝胶自然下沉于柱内，直至达到所需的高度，将洗脱液浸过凝胶表面，以免混入空气。稍放置一段时间，进行流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。平衡过程中逐渐增加至层析时的流速，但不能超过层析时的最终流速。平衡凝胶柱过夜。使用前要检查层析柱是否分布均匀，不能有气泡或裂纹存在。可加一些有色物质进行检验，观察色带的移动，性能良好的层析柱色带狭窄，均匀平整，若色带歪曲，散乱，变宽则必须重新装柱。
上柱
洗脱液液面恰好与凝胶床的表面位于同一平面时加入样品混合液。样品混合液体积通常为凝胶床体积的5%-10%，不能超过30%。样品加入后打开流出口，使样品渗入到凝胶床内。
洗脱
当样品液面恰与凝胶床表面相平时，加进约为凝胶床体积120%的洗脱液进行洗脱，分部收集洗脱液即可分离各组分。
凝胶过滤层析对于高分子物质有很好的分离效果，所用的凝胶属惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，因此对所分离组分的理化性质的保持具有较好的优势，目前在生物化学实验中广泛应用。
亲和层析
某些生物分子的特定结构部位能够同其他生物子的相应结构识别并结合，如受体与配体的识别结合，酶与低物的识别结合等，这种结合是特异的，可逆的，改变条件可以解除这种结合。生物分子间的这种结合能力叫做亲和力。亲和层析就是根据该原理设计的物质分离纯化方法。
亲和层析是利用分子与其配体间专一可逆的结合作用进行物质分离的技术。其专一性，选择性高，通过一次亲和层析操作，可把目的组分从混合物中分离出来，尤其对含量甚微组分的分离具有良好的效果。此法具有高效，快速，简便等优点。亲和层析中，将可亲和的一对分子之一以共价键连接到不溶性载体上，成为固定相。当样品混合物流经此固定相时，只有和固定相分子有相流出，然后用洗脱液将结合的亲和物洗脱下来。
在亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称为配基。可以作为基质的有玻璃球，石英微球，氧化铝，聚丙烯酰胺凝胶，葡聚糖凝胶，纤维素和琼脂糖等。以琼脂糖最为常用。配基的固定化方法有多种，包括物理吸附法，载体结合法，包埋法和交联法等四类。以下简要介绍亲和层析的基本扣件过程。
（1）选择能被待分离的目的分子（配体）识别并可逆结合配基。
（2）把配基共价结合到基质上，即配基的固定化。
（3）把基质-配基复合物灌装在层析柱内做成亲和柱。
（4）上样亲和→洗涤杂质→洗脱收集配体→亲和柱再生。
亲和层析实验条件温和，过程简单，反应迅速，分离效率高，可避免一些不稳定的物质在纯化过程中的变性失活。但是分离某种物质需要制备相应的特异性层析柱和建立相应的实验条件，配基的选择及其固定化操作比较繁琐，因此其应用受到一定限制。高效亲和层析，具有高特异性和高速性的特点，可与高效液相层析技术配合使用，加大分析浓度，该技术将在未来的生物化学实验中发挥更大的作用。
印迹技术
将各种生物大分子(核酸、蛋白质等)从凝胶转移到种固定基质上的过程称为印迹技术。1975年英国人Southerm首先提出了分子印迹的概念。他首先将不同长度片段DNA分子进行琼脂 糖凝胶电泳，并在凝胶中变性使其成为单链，然后将-张硝酸纤维素 (NC)膜放在凝胶上，NC 膜上放有吸水纸巾，由于虹吸原理，凝胶中的DNA片段转移到NC膜上，成为固相化分子。将 载有DNA单链分子的NC膜置于杂交液与带有标记的探针(DNA或RNA分子)进行杂交，具 有互补序列的探针结合到存在于NC膜上的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术显现出 杂交分子的区带。类似于用吸墨纸吸取纸张上的墨迹，因此称为“botting", 译为印迹技术。1977 年，在Southerm blotting的基础上，Alwine 进行改进，用以研究RNA,将其诙谐地称为Northem blotting; 1979 年，Towbin 建立Westerm blotting,即蛋白印迹，也叫免疫印迹。在过去的几十年 中，生物大分子印迹技术迅猛发展，已广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测。目前印迹技术主要 有Southem印迹( Southern blotting )、Northerm 印迹( Northerm blotting )、Western 印迹(Westem boting)以及斑点印迹(Dot botting)等。
一、生物大分子凝胶电泳分离
印迹的第一步是将生物大分子按其相对分子质量的大小进行凝胶电泳分离。通常情况下， DNA印迹首先将DNA分子用限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，由于双链DNA不能结 合到NC膜上，因此电泳后需碱处理凝胶，使DNA变性成单链结构; RNA印迹与DNA相似， 由于碱会使RNA降解，故不能用碱变性;蛋白印迹通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。
二、固相支持物的选择
由于凝胶易碎、易扩散，很难对其进行处理以检测目的条带，因此，需要把凝胶上的分子条 带转移并固定到固相支持物上，形成稳定、容易被检出的固定化生物大分子。目前常用的固相支 持物有NC膜、尼龙膜等，与生物大分子非共价结合。NC膜较便宜，结合容量大，因而广泛应 用。尼龙膜对于生物大分子的结合容量更大，在印迹时，生物大分子不易穿过膜造成损失，但背 景较高。NC膜不能用于RNA印迹，尼龙膜对于DNA、RNA结合能力均较强，可以重复使用， 因此DNA、RNA印迹常用尼龙膜。
三、转移
印迹的方法目前主要有毛细管虹吸转移、电转移和真空转移。
(一)毛细管虹吸转移
毛细管虹吸转移是利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相膜上。该法不需要专门设备，操作简单，重复性好。核酸分子 转移的速度取决于核酸分子的大小及凝胶的浓度 和厚度，核酸分子越小、凝胶浓度越低、凝胶厚 度越薄，转移速度越快。毛细管虹吸转移需要的 时间较长，不适合用于小孔径凝胶上分子的转移。
（二）电转移
电转移目前应用非常广泛，是利用电场作用将核酸从凝胶转移到固相膜上。为了获得有效的印迹，电转移要在强电流下进行，但高强电流往往会产生过高的热量，必须采用冷却系统进行冷却，电印迹缓冲液以低离子强度为好。电印迹缓冲液里往往加入甲醇，甲醇的作用是使阴离子去污 剂(SDS)游离出来，增加NC膜的结合容量，提高NC膜与分子的结合力，防止凝胶肿胀。但是过多的甲醇能改变凝胶中大分子物质的电荷，使凝胶孔径缩小，影响转印的效率。印迹时间、电流 强度、凝胶的孔径等条件必须经过反复的摸索，采用适宜的条件才能得到比较好的效果。见图7。
(三)真空转移
真空转移法是转移缓冲液从上层容器通过凝胶和固相膜被抽到下层真空室内，同时带动凝胶 上的核酸片段从凝胶转移到固相膜上。该法具有简单、迅速、高效的特点。见图8。
四、常用的几种印迹方法
(一) Southerm印迹
Southern印迹将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，Southern 印迹是进行基因 组DNA特定序列定位的通用方法。DNA经限制性内切酶消化成片段后用琼脂糖凝胶电泳进行分 离，然后将凝胶上的DNA变性成单链并在原位将其转移至NC膜、尼龙膜或其他固相支持物上， 经干烤或者紫外线照射固定，再与具有特定标记的探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色， 检测特定DNA分子。
Southern印迹包括两个主要过程: -是印迹( blotting),即将待测核酸分子转移并结合到一 定的固相支持物占二是分子杂交，即固定于膜上的DNA同标记的探针在一定条件 下退火，缔合成双链。印迹方法目前除了虹吸法，现已发展为电转法、真空转移法等多种方法;滤膜常用的 有NC膜、尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。
Southerm印连基本步骤:①从组织中提取DNA:②用特定的核酸内切酶酶切:③琼脂糖凝胶 电泳;④碱变性;⑤中和反应;⑥转膜;⑦预杂交;⑧杂交;⑨杂交信号检制。
实验中应注意的问题:①转膜必须充分，要保证凝胶上的DNA已转到膜上:②杂交条件及 漂洗是保证阳性结果和条带与背景反差强烈的关键，如洗膜不充分会导致背景过高，而洗膜过度 可导致假阴性结果;③注意环保及安全。
利用 Southern印连法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某基因的定性及定量分
析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。
(二)Northerm印迹
Northerm印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。Northern 印迹 与Southerm印迹转膜方法相似，只是变性的方法不同: Northerm 印迹不用碱变性(因为NaOH会 水解RNA的2'-羟基)，在上样前用甲醛、乙二醛或甲基氢氧化银等使RNA变性，RNA变性后 有利于与膜结合。甲基氢氧化银是一种强力、可逆的变性剂，但是有毒，因而普遍采用甲醛作为 变性剂。高盐中转膜，低盐中洗脱，胶中不加溴化乙锭( EB )( EB会影响RNA与硝酸纤维索膜 的结合)。
Northern印迹基本步骤:①提取总RNA;②变性后进行琼脂糖凝胶电泳;③转膜;④固定;⑤杂交;⑥杂交值号检测, Northerm 印迹全过程所有操作均应避免RNA酶( Rnase )的污染。
(三) Western印进
Wetem印通技术是一种蛋白质的固定 和分析技术，是将蛋白质电泳，印迹、免疫测定险为 一体的特导性蛋户质的检测方法。 其原理是:先从样品中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白样品溶 于含休去污和和还原剂的溶液中，进行SDS-PAGE电泳，蛋白质按照相对分子质量的大小被分 离。然后将被分离的蛋白质原位转移到周相支持物(NC膜或尼龙膜等)上，将膜浸于高浓度的 蛋白质溶液中温育，使膜上未结合蛋白质的部分均结合上蛋白质而被封闭。加入特异性抗体(- 抗)进行孵育，膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合。-抗结合后再加入能与 抗特异性结合的 带标记的二抗，最后通过二抗上标记物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进 行检测，从而得知样品中目的蛋白的表达情况。
Westem印迹的基本步骤:①蛋白质样品制备;②SDS-PAGE电泳;③转膜;④封闭;⑤- 抗孵育;⑥二抗孵育;⑦显色;⑧对于显色结果进行分析。
Westerm印迹方法灵敏度高，通常可检测出50 ng的微量目的蛋白。
(四)斑点印迹
将样品点在支持膜上进行分子杂交的技术。如将核酸点在能与核酸结合的膜(如NC膜、尼龙膜等)上，经处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子杂交。用放射自显影或非放射性显色检测，判断是否有杂交以及杂交强度，可作定性或半定量分析。斑点印迹主要用于基因缺 失或拷贝数改变的检测。常见的斑点杂交技术有DNA斑点杂交、RNA斑点杂交和完整细胞斑点 杂交等。该方法耗时短，一-张膜上可同时检测多个样品。
斑点印迹的基本步骤:①膜预处理;②点样;③预杂交;④杂交;⑤加抗体;⑥显色。
